子宮内のエレクトロポレーションを使用して、マウス脳のCRISPR/CAS9を介した遺伝子ノックアウト

このユニットは、標的遺伝子に対するヒト化CAS9およびシングルガイドRNA（SGRNA）を発現するPX330プラスミドを使用して、発達中のマウス脳における遺伝子の脳特異的破壊の非常に効率的かつ迅速な手順について説明しています。PX330プラスミドは、子宮内のエレクトロポレーションを使用してげっ歯類の脳に送達されます。ATリッチなDNA結合転写因子をコードするSATB2遺伝子に焦点を当て、PX330-SATB2誘導挿入/欠失（INDEL）変異の導入がSATB2遺伝子の予測された切断部位の近くで、劇的な減少をもたらすことがわかりました。ミトーシス後のニューロンにおけるSATB2発現の。さらに、PX330-SATB2の導入により、軸索投影パターンの異常が誘導されました。これは、SATB2変異マウスで観察された表現型と一致していました。したがって、CRISPR/Cas9システムと子宮内のエレクトロポレーションを組み合わせたここで説明する手順は、生きているげっ歯類の脳に関心のある遺伝子をノックアウトするのに役立ちます。©2017 by John Wiley＆Sons、Inc。

This unit describes a highly efficient and rapid procedure for brain-specific disruption of genes in the developing mouse brain using pX330 plasmids expressing humanized Cas9 and single-guide RNAs (sgRNAs) against target genes. The pX330 plasmids are delivered into the rodent brain using in utero electroporation. Focusing on the Satb2 gene, which encodes an AT-rich DNA-binding transcription factor, we found that the introduction of pX330-Satb2 induced insertion/deletion (indel) mutations near the predicted cleavage site in the Satb2 gene, resulting in a dramatic reduction of Satb2 expression in post-mitotic neurons. Moreover, introduction of pX330-Satb2 induced abnormalities in axonal projection patterns, which was consistent with the phenotypes observed in Satb2 mutant mice. Thus, the procedure described here, combining the CRISPR/Cas9 system and in utero electroporation, is useful for knocking out genes of interest in the living rodent brain. © 2017 by John Wiley & Sons, Inc.