ヒト組換えエリスロポエチン（Repo）の残留宿主細胞DNAを検出および定量化する新しい方法の設計と検証

宿主細胞からのヒト組換えエリスロポエチン（レポ）の精製中、残留DNAは最終産物に残ることがあります。この汚染は患者の危険因子であり、その濃度がWHOによって定義された標準よりも多い場合、いくつかの腫瘍抑制遺伝子の不活性化または癌遺伝子の活性化をもたらす可能性があります。WHOの基準に基づいて、バイオ医薬品の残留DNAの許容レベルは10〜100 pg/用量です。この研究では、ヒトRepo産物における残留DNAの検出のために、敏感で特異的な定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アッセイを設計しました。CHOのGAPDH遺伝子の報告されたすべてのシーケンスはGenBankから取得され、MEGA 6ソフトウェアを使用して複数のアラインメントを実行して、遺伝子の保存された領域を見つけました。プライマーとプローブは、高度に保存された領域向けにArleleID7ソフトウェアによって設計されました。定量的リアルタイムPCRは、0.99を超えるR2値を示し、効率は101％に等しいことを示し、それぞれ反応の非常に正確で効率を示しています。標準曲線に基づいて、アッセイの検出限界は、10コピー/µL（0.00967 FG/µL）であると判断されました。さらに、テストのアッセイ間およびアッセイ内および内部は、それぞれ1.14％と0.65％であると判断され、WHOのガイドラインに従って許容範囲にあります。

During the purification of human recombinant erythropoietin (rEPO) from host cells, residual DNA may remain in final products. This contamination is a risk factor for patients and may result in the inactivation of some tumor suppressor genes or activation of oncogenes if its concentration is more than the standard defined by WHO. Based on WHO's criteria, acceptable level of residual DNA in biopharmaceuticals is less than 10-100 pg/dose. In this study, we have designed a sensitive and specific quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) assay for the detection of residual DNA in human rEPO products. All reported sequences of CHO's GAPDH gene were retrieved from GenBank, and a multiple alignment was performed using Mega 6 software to find conserved regions of the gene. Primers and probe were designed by AlleleID7 software for the highly conserved region. Quantitative real-time PCR showed an R2 value more than 0.99 and the efficiency equal to 101% indicating a highly accurate and efficiency of the reaction, respectively. Based on the standard curve, the limit of detection of the assay was determined to be 10 copies/µL (0.00967 fg/µL). In addition, the inter- and intra-assay of the test were determined to be 1.14% and 0.65%, respectively, which are in acceptable range according to the WHO's guidelines.