破傷風毒素と破傷風のトキソイド構造を探索するための分析ツールの組み合わせた使用

アルデヒド解毒は、ワクチン用途のために毒素をトキソイドに変換するために使用されるプロセスです。破傷風毒素（TT）の場合、ホルムアルデヒドは、破傷風ワクチンまたは共役ワクチンのキャリアタンパク質として使用されるテタヌストキソイド（TTD）を得るために使用されます。この解毒の正確なメカニズムをよりよく理解するために、いくつかの研究がすでに実施されています。これらの研究は、ラボスケールTTDサンプルでの多くのホルムアルデヒド誘発性修飾の同定につながりました。ホルムアルデヒドによって引き起こされる変化のより大きな洞察を得るために、3つの産業TTDバッチを使用して、解毒プロセスで再現可能な修飾を特定しました。私たちの戦略は、これらの変更をマッピングするために7つの分析ツールを組み合わせることでした。質量分析（MS）、比色測定試験およびアミノ酸分析（AAA）を使用して、アミノ酸の修飾を研究しました。SDS-PAGE、非対称の流れ場の流れ分別（AF4）、蛍光分光法、および循環二色性（CD）を使用して、タンパク質構造全体のホルムアルデヒド修飾を研究しました。TTの1315アミノ酸一次シーケンスにわたって、41のホルムアルデヒド誘発性修飾を特定しました。これらのうち、リジン残基の5つの修飾は、TTDバッチ全体で再現可能でした。タンパク質の立体構造の変化は、SDS-PAGE、AF4、およびCD技術を使用しても観察されました。各分析ツールは、ホルムアルデヒド誘導修飾に関する情報をもたらし、すべてを合わせて、これらの方法は、解毒で発生した構造変化の包括的な概要を提供しました。これらの結果は、ホルムアルデヒドを使用せずに非毒性等価タンパク質の産生を可能にする可能性のある部位指向TT変異誘発研究につながる最初のステップである可能性があります。

Aldehyde detoxification is a process used to convert toxin into toxoid for vaccine applications. In the case of tetanus toxin (TT), formaldehyde is used to obtain the tetanus toxoid (TTd), which is used either for the tetanus vaccine or as carrier protein in conjugate vaccines. Several studies have already been conducted to better understand the exact mechanism of this detoxification. Those studies led to the identification of a number of formaldehyde-induced modifications on lab scale TTd samples. To obtain greater insights of the changes induced by formaldehyde, we used three industrial TTd batches to identify repeatable modifications in the detoxification process. Our strategy was to combine seven analytical tools to map these changes. Mass spectrometry (MS), colorimetric test and amino acid analysis (AAA) were used to study modifications on amino acids. SDS-PAGE, asymmetric flow field flow fractionation (AF4), fluorescence spectroscopy and circular dichroism (CD) were used to study formaldehyde modifications on the whole protein structure. We identified 41 formaldehyde-induced modifications across the 1315 amino acid primary sequence of TT. Of these, five modifications on lysine residues were repeatable across TTd batches. Changes in protein conformation were also observed using SDS-PAGE, AF4 and CD techniques. Each analytical tool brought a piece of information regarding formaldehyde induced-modifications, and all together, these methods provided a comprehensive overview of the structural changes that occurred with detoxification. These results could be the first step leading to site-directed TT mutagenesis studies that may enable the production of a non-toxic equivalent protein without using formaldehyde.