溶解物からの天然タンパク質上の単一分子アッセイによって明らかにされたSOS PRドメイン自己阻害のメカニズム

セブンレス（SOS）のグアニンヌクレオチド交換因子（GEF）の息子は、Rasを活性化することにより、シグナル伝達において重要な役割を果たします。ここでは、RAS機能化された支持膜マイクロアレイを使用して、個々のSOS分子が生細胞溶解物から捕獲される単一分子アッセイを導入します。これにより、精製が困難なため再構成では以前に研究されていなかったフルレングスSOSタンパク質の特性評価が可能になります。全長タンパク質の測定値は、よく知られているN末端ドメイン自己阻害とは無関係にアロステリックRAの関与を妨害するためのC末端プロリンリッチ（PR）ドメインの明確な役割を明らかにしています。PRドメインのこの抑制的役割は、SOSアロステリック結合部位におけるRas・GTPの結合を介して膜へのSOSのGRB2に依存しない動員を制限します。より一般的には、このアッセイ戦略により、単一分子精度でGEFの機能的挙動の特性評価が可能になりますが、精製は必要ありません。

The guanine nucleotide exchange factor (GEF) Son of Sevenless (SOS) plays a critical role in signal transduction by activating Ras. Here we introduce a single-molecule assay in which individual SOS molecules are captured from raw cell lysate using Ras-functionalized supported membrane microarrays. This enables characterization of the full-length SOS protein, which has not previously been studied in reconstitution due to difficulties in purification. Our measurements on the full-length protein reveal a distinct role of the C-terminal proline-rich (PR) domain to obstruct the engagement of allosteric Ras independently of the well-known N-terminal domain autoinhibition. This inhibitory role of the PR domain limits Grb2-independent recruitment of SOS to the membrane through binding of Ras·GTP in the SOS allosteric binding site. More generally, this assay strategy enables characterization of the functional behaviour of GEFs with single-molecule precision but without the need for purification.