IlluminaMiseqプラットフォームを使用したアンプリコンシーケンスの再現性の評価

イルミナのMiseqは、微生物生態学研究における遺伝子アンプリコンシーケンスの支配的なプラットフォームになりました。ただし、再現性などのさまざまな技術的懸念は依然として存在しています。再現性を評価するために、相互移植実験の18の土壌サンプルからの16S rRNA遺伝子アンプリコンをイルミナmiseqで配列決定しました。各サンプルからの16S rRNA遺伝子のV4領域は、一意のバーコードを持つ各複製と3回シーケンスされました。シーケンスの存在量を考慮せずに、平均OTUのオーバーラップは、10,323シーケンスの希土類レベルで、2回と3回の技術的複製の間でそれぞれ33.4±2.1％および20.2±1.7％でした。OTUシーケンスの存在量を考慮した場合、平均シーケンスの存在量の加重OTUオーバーラップは、2回と3回の複製でそれぞれ85.6±1.6％および81.2±2.1％でした。シングルトンを除去すると、両方のオーバーラップが大幅に増加しました（〜1〜3％、p <0.001）。シーケンスの存在量が考慮された場合（95％）（44％）と考慮された場合（95％）（44％）の両方で、深いシーケンスによってシーケンスの深さを160,000読みに増やすことで、OTUの重複が増加しました。ただし、シングルトンが削除されなかった場合、30,000シーケンスで39％の2つの技術的複製（シーケンスの存在量を考慮していない）のプラトーの間の重複。α-ダイバーは技術的な複製の間で類似していたが、β-ダイバー（Bray-Curtis）は治療複製（例えば0.269対0.374）よりもはるかに小さいため、α-ダイバーは技術的な複製の間で類似していたため、低い重複の影響を受けませんでした。多様性の高いカバレッジが高いが、OTUのオーバーラップが低いことが、複製が別々の実行でシーケンスされたときに観察されました。ディトレンドの通信分析は、技術的な複製の間にかなりのばらつきがあったが、再現性は調べたサンプルの治療効果を検出するのに十分であることを示した。これらの結果は、技術的な複製の間にはばらつきがありますが、MISEQでのアンプリコンシーケンスは、適切かつ慎重に使用する場合、微生物群集構造を分析するのに役立つことを示唆しています。たとえば、技術的な複製、スプリアスシーケンスと代表的なOTUの削除、OTU生成のひどいクラスタリング方法を使用して、より高い分類学的レベルでの治療効果を推定し、ユニークな分子識別子（UMI）およびその他の新しく開発された方法を適応させるなどPCRおよびシーケンスエラー、および真の低存在量の希少種を特定するために、すべて再現性を高めることができます。

Illumina's MiSeq has become the dominant platform for gene amplicon sequencing in microbial ecology studies; however, various technical concerns, such as reproducibility, still exist. To assess reproducibility, 16S rRNA gene amplicons from 18 soil samples of a reciprocal transplantation experiment were sequenced on an Illumina MiSeq. The V4 region of 16S rRNA gene from each sample was sequenced in triplicate with each replicate having a unique barcode. The average OTU overlap, without considering sequence abundance, at a rarefaction level of 10,323 sequences was 33.4±2.1% and 20.2±1.7% between two and among three technical replicates, respectively. When OTU sequence abundance was considered, the average sequence abundance weighted OTU overlap was 85.6±1.6% and 81.2±2.1% for two and three replicates, respectively. Removing singletons significantly increased the overlap for both (~1-3%, p<0.001). Increasing the sequencing depth to 160,000 reads by deep sequencing increased OTU overlap both when sequence abundance was considered (95%) and when not (44%). However, if singletons were not removed the overlap between two technical replicates (not considering sequence abundance) plateaus at 39% with 30,000 sequences. Diversity measures were not affected by the low overlap as α-diversities were similar among technical replicates while β-diversities (Bray-Curtis) were much smaller among technical replicates than among treatment replicates (e.g., 0.269 vs. 0.374). Higher diversity coverage, but lower OTU overlap, was observed when replicates were sequenced in separate runs. Detrended correspondence analysis indicated that while there was considerable variation among technical replicates, the reproducibility was sufficient for detecting treatment effects for the samples examined. These results suggest that although there is variation among technical replicates, amplicon sequencing on MiSeq is useful for analyzing microbial community structure if used appropriately and with caution. For example, including technical replicates, removing spurious sequences and unrepresentative OTUs, using a clustering method with a high stringency for OTU generation, estimating treatment effects at higher taxonomic levels, and adapting the unique molecular identifier (UMI) and other newly developed methods to lower PCR and sequencing error and to identify true low abundance rare species all can increase reproducibility.