ヒト病原性ムコールムコールcircinelloidesにおけるリサイクル可能な遺伝的マーカーと連続遺伝子欠失の構築

Mucor circinelloidesは、基底菌系統に属するヒト病原体、バイオ燃料生産者、およびモデルシステムです。ただし、この真菌の遺伝学は限られています。子嚢菌や脳乳細胞とは対照的に、基礎真菌系統は研究されていません。これは、これらの真菌に与えられた注意の欠如と、遺伝的分析のための限られたツールによって引き起こされる可能性があります。それにもかかわらず、これらの真菌の病原体およびモデルシステムとしての重要性は増加しています。M. circinelloidesは、基底菌における遺伝的に扱いやすい生物の1つですが、ディカリヤのサブドダムの真菌と比較すると、堅牢な遺伝子系とはほど遠いものです。1つの問題は、生物が他の真菌変換システムの支配的なマーカーを選択するために利用される薬物に耐性があることです。したがって、PYRG遺伝子（Saccharomyces cerevisiaeのURA3のオルソログ、オロチジン-5'-リン酸デカルボキシラーゼをコードする）を使用して、ブラスターリサイクル可能なマーカーシステムを開発しました。PYRG遺伝子の下流の237 bpフラグメントは、遺伝子の上流領域にタンデムに組み込まれ、Pyrg-DPL237マーカーの構築をもたらしました。Pyrg-DPL237マーカーの機能をテストするために、Pyrg-Mutantのバックグラウンドでカロテノイド合成に関与しているCARRP遺伝子を破壊しました。得られたCarrp :: Pyrg-Dpl237変異体は、カロチンの不足により白いコロニーの表現型を示しますが、野生型は黄色がかったコロニーを示します。その後、PYRGマーカーを正常に切除し、5-FOA培地でCARRP-DPL237を生成しました。変異体は耳酸栄養性になり、成長のためにウリジンを必要としました。次に、CARP :: DPL237株のカルシニューリンB調節サブユニットCNBR遺伝子を混乱させ、対立遺伝子CARP :: DPL237およびCNBR :: PYRGで変異体を生成しました。これらの結果は、リサイクル可能なマーカーシステムが完全に機能していることを示しています。マーカーは、M。circinelloidesの連続遺伝子欠失に使用できます。

Mucor circinelloides is a human pathogen, biofuel producer, and model system that belongs to a basal fungal lineage; however, the genetics of this fungus are limited. In contrast to ascomycetes and basidiomycetes, basal fungal lineages have been understudied. This may be caused by a lack of attention given to these fungi, as well as limited tools for genetic analysis. Nonetheless, the importance of these fungi as pathogens and model systems has increased. M. circinelloides is one of a few genetically tractable organisms in the basal fungi, but it is far from a robust genetic system when compared to model fungi in the subkingdom Dikarya. One problem is the organism is resistant to drugs utilized to select for dominant markers in other fungal transformation systems. Thus, we developed a blaster recyclable marker system by using the pyrG gene (encoding an orotidine-5'-phosphate decarboxylase, ortholog of URA3 in Saccharomyces cerevisiae). A 237-bp fragment downstream of the pyrG gene was tandemly incorporated into the upstream region of the gene, resulting in construction of a pyrG-dpl237 marker. To test the functionality of the pyrG-dpl237 marker, we disrupted the carRP gene that is involved in carotenoid synthesis in pyrG- mutant background. The resulting carRP::pyrG-dpl237 mutants exhibit a white colony phenotype due to lack of carotene, whereas wild type displays yellowish colonies. The pyrG marker was then successfully excised, generating carRP-dpl237 on 5-FOA medium. The mutants became auxotrophic and required uridine for growth. We then disrupted the calcineurin B regulatory subunit cnbR gene in the carRP::dpl237 strain, generating mutants with the alleles carRP::dpl237 and cnbR::pyrG These results demonstrate that the recyclable marker system is fully functional, and therefore the pyrG-dpl237 marker can be used for sequential gene deletions in M. circinelloides.