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ヒト脳のサンプルは、23の致命的な熱脳卒中症例と23の年齢患者が一致するコントロールを含む46の剖検症例から収集されました。QBaseplusソフトウェアのGenorm Moduleを使用して、9つの候補参照遺伝子（PES1、POS1、POLR2A、IPO8、HMBS、SDHA、GAPDH、UBC、B2M、ACTB）を評価しました。SDHA、POLR2A、IPO8、およびHMBSは、最も安定した参照遺伝子として特定されました。これらの検証済みの参照遺伝子を使用して、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP、MMP2およびMMP9）、Claudin5（Cldn5）、Occludin（OCLN）、Zona Occludens Protein-1（ZO1）、およびAquaporins（AQPS、AQP4）のCEREBRAL COTEXのAQPS）のmRNA発現を使用しています。TAQMANリアルタイムPCRアッセイを使用した相対mRNAの定量化により、熱ストローク症例でMMP9、CLDN5、OCLN、ZO1、およびAQP4の校正正規化相対量（CNRQ）値の増加が示されました。熱ストロークの症例は、脳の水分含有量の増加を示し、これはMMP9、OCLN、ZO1、およびCLDN5 mRNAと正の相関があることがわかった。正規化に1つの従来の参照遺伝子（GAPDHまたはACTB）を使用する場合、熱ストロークとコントロールの間に差は検出されませんでした。免疫染色では、ほとんどの熱ストロークの場合でより強い染色を示したのはAQP4だけでした。本研究は、熱ストロークにおける脳のMMP9、CLDN5、OCLN、ZO1、およびAQP4の増加を初めて報告し、ポスト死後のヒト組織を使用する際の参照遺伝子選択の重要な役割を示唆しています。
ヒト脳のサンプルは、23の致命的な熱脳卒中症例と23の年齢患者が一致するコントロールを含む46の剖検症例から収集されました。QBaseplusソフトウェアのGenorm Moduleを使用して、9つの候補参照遺伝子（PES1、POS1、POLR2A、IPO8、HMBS、SDHA、GAPDH、UBC、B2M、ACTB）を評価しました。SDHA、POLR2A、IPO8、およびHMBSは、最も安定した参照遺伝子として特定されました。これらの検証済みの参照遺伝子を使用して、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP、MMP2およびMMP9）、Claudin5（Cldn5）、Occludin（OCLN）、Zona Occludens Protein-1（ZO1）、およびAquaporins（AQPS、AQP4）のCEREBRAL COTEXのAQPS）のmRNA発現を使用しています。TAQMANリアルタイムPCRアッセイを使用した相対mRNAの定量化により、熱ストローク症例でMMP9、CLDN5、OCLN、ZO1、およびAQP4の校正正規化相対量（CNRQ）値の増加が示されました。熱ストロークの症例は、脳の水分含有量の増加を示し、これはMMP9、OCLN、ZO1、およびCLDN5 mRNAと正の相関があることがわかった。正規化に1つの従来の参照遺伝子（GAPDHまたはACTB）を使用する場合、熱ストロークとコントロールの間に差は検出されませんでした。免疫染色では、ほとんどの熱ストロークの場合でより強い染色を示したのはAQP4だけでした。本研究は、熱ストロークにおける脳のMMP9、CLDN5、OCLN、ZO1、およびAQP4の増加を初めて報告し、ポスト死後のヒト組織を使用する際の参照遺伝子選択の重要な役割を示唆しています。
Human brain samples were collected from 46 autopsy cases, including 23 fatal heat stroke cases and 23 age-matched controls. Nine candidate reference genes (PES1, POLR2A, IPO8, HMBS, SDHA, GAPDH, UBC, B2M, ACTB) were evaluated in the cerebral cortex of 10 forensic autopsy cases (5 heat stroke and 5 controls), using the geNorm module in qBaseplus software. SDHA, POLR2A, IPO8 and HMBS were identified as the most stable reference genes. Using these validated reference genes, mRNA expressions of Matrix metalloproteinases (MMPs, MMP2 and MMP9), Claudin5 (CLDN5), Occludin (OCLN), Zona occludens protein-1 (ZO1) and Aquaporins (AQPs, AQP1 and AQP4) in the cerebral cortex were examined. Relative mRNA quantification using Taqman real-time PCR assay demonstrated increased calibrated normalized relative quantity (CNRQ) values of MMP9, CLDN5, OCLN, ZO1 and AQP4 in heat stroke cases. Heat stroke cases showed an increase in brain water content, which was found to be positively correlated with MMP9, OCLN, ZO1 and CLDN5 mRNA. When using one conventional reference gene (GAPDH or ACTB) for normalization, no difference was detected between heat stroke and controls. In immunostaining, only AQP4 showed more intense staining in most heat stroke cases. The present study, for the first time, reports increased cerebral MMP9, CLDN5, OCLN, ZO1 and AQP4 in heat stroke and suggest a crucial role of reference gene selection when using postmortem human tissues.
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