αvβ3、αvβ5、およびα5β1インテグリン受容体への非標識RGDペプチドの結合強度を迅速に評価するための新しいツールとしての高親和性RGD-ノッティンペプチドとして

細胞、ECMタンパク質、または抗体を使用せずに、ハイスループット中のRGDペプチドのインテグリン結合を測定するための非常に敏感な競合ELISAについて説明します。アッセイ測定（非標識）RGD-ペプチドのビオチン化「ノッティン」-RGDペプチドの結合を表面に固定したインテグリンに阻害する能力、したがって、高、中性、および低親和性のRGDの結合強度の定量化を可能にします- バインダー。インテグリン結合は3つのインテグリンすべてではるかに強く、明確に検出できるため、ビオチン化シクロ[RGDFK]（Piras et al。によって報告されているように）の代わりにビオチン化ノッティン-RGDペプチドを導入しました。感度と費用効率を最大化するために、最初にインテグリンの不調整レベル、ノッティンRGD濃度、緩衝液組成物、検出タグの種類（ビオチン、HIS、またはCMYCタグ）、スペーサーの長さなど、いくつかのパラメーターを最適化しました。それにより、2つの重要な要因、つまり、（i）臨界スペーサーの長さ（Glyより長い）、（ii）すべてのインキュベーションおよび洗浄バッファーにおけるCa2+およびMg2+の存在を特定しました。Knottin-RGDペプチドの結合はαvβ3で最も強かったが、αvβ5とα5β1の両方で検出可能であったが、ビオチン化シクロ[rgdfk]の結合は非常に弱く、αvβ3でのみ検出可能でした。アッセイの検証のために、3つの非標識ペプチドのIC50値、つまり、（i）線形GRGD、（ii）シクロ[RGDFK]、および（iii）3つの異なるインテグリン受容体に結合するためのKnottin-RGD自体を決定しました（αVβ3、αvβ5、α5β1）。新しいアッセイの主な利点は、（i）インテグリンの極端な消費量（50 ng/ペプチド）、（ii）検出には抗体/ECMタンパク質もインテグリン発現細胞も必要ないという事実、および（iii）（RGD-）ペプチドライブラリーのハイスループットスクリーニングへの適合性。

We describe a highly sensitive competition ELISA to measure integrin-binding of RGD-peptides in high-throughput without using cells, ECM-proteins, or antibodies. The assay measures (nonlabeled) RGD-peptides' ability to inhibit binding of a biotinylated "knottin"-RGD peptide to surface-immobilized integrins and, thus, enables quantification of the binding strength of high-, medium-, and low-affinity RGD-binders. We introduced the biotinylated knottin-RGD peptide instead of biotinylated cyclo[RGDfK] (as reported by Piras et al.), as integrin-binding was much stronger and clearly detectable for all three integrins. In order to maximize sensitivity and cost-efficiency, we first optimized several parameters, such as integrin-immobilization levels, knottin-RGD concentration, buffer compositions, type of detection tag (biotin, His- or cMyc-tag), and spacer length. We thereby identified two key factors, that is, (i) the critical spacer length (longer than Gly) and (ii) the presence of Ca2+ and Mg2+ in all incubation and washing buffers. Binding of knottin-RGD peptide was strongest for αvβ3 but also detectable for both αvβ5 and α5β1, while binding of biotinylated cyclo[RGDfK] was very weak and only detectable for αvβ3. For assay validation, we finally determined IC50 values for three unlabeled peptides, that is: (i) linear GRGDS, (ii) cyclo[RGDfK], and (iii) the knottin-RGD itself for binding to three different integrin receptors (αvβ3, αvβ5, α5β1). Major benefits of the novel assay are (i) the extremely low consumption of integrin (50 ng/peptide), (ii) the fact that neither antibodies/ECM-proteins nor integrin-expressing cells are required for detection, and (iii) its suitability for high-throughput screening of (RGD-)peptide libraries.