TCR架橋は、チロシンリン酸化CD3ζ鎖へのCRKアダプタータンパク質結合を促進する

表面MHC分子の文脈における抗原提示細胞（APC）によって提示されたペプチド抗原のT細胞抗原受容体（TCR）結合は、T細胞の活性化、増殖、および分化を調節するシグナル伝達イベントを開始します。活性化プロセスの重要なイベントは、SH2ドメイン含有エフェクタータンパク質のドッキング部位として動作するCD3鎖免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ITAMS）内の保存されたチロシン残基のリン酸化です。CD3ζITAMSのリン酸化は、T細胞の活性化に不可欠なタンパク質チロシンキナーゼであるζ鎖関連タンパク質70 kDa（ZAP70）を結合できるCD3鎖をレンダリングします。Jurkat T細胞のTCR/CD3架橋は、CRKアダプタータンパク質と一時的にリン酸化されたCD3ζ鎖との関連を促進することがわかりました。ビードを固定化したGST融合タンパク質を使用したプルダウンアッセイは、CRK-SH2ドメインがホスホ-CD3ζの結合を媒介することを明らかにしました。ホスホ-CD3ζ結合は選択的であり、CRKI、CRKII、CRKLを含む3種類のCRKによって媒介されますが、GRB2、GRAP、NCKなどの他のSH2ドメイン含有アダプタータンパク質によっては媒介されません。ホスホ-CD3ζとのCRK相互作用は迅速かつ一時的であり、TCR/CD3の架橋後1分後にピークに達します。この結果は、CRKがリン酸3ζの近くにエフェクタータンパク質を動員するのに役立ち、TCR/CD3共役シグナル伝達経路の微調整に寄与するT細胞活性化の初期段階におけるCRKアダプタータンパク質の関与を示唆しています。

T cell antigen receptor (TCR) binding of a peptide antigen presented by antigen-presenting cells (APCs) in the context of surface MHC molecules initiates signaling events that regulate T cell activation, proliferation and differentiation. A key event in the activation process is the phosphorylation of the conserved tyrosine residues within the CD3 chain immunoreceptor tyrosine-based activation motifs (ITAMs), which operate as docking sites for SH2 domain-containing effector proteins. Phosphorylation of the CD3ζ ITAMs renders the CD3 chain capable of binding the ζ-chain associated protein 70 kDa (ZAP70), a protein tyrosine kinase that is essential for T cell activation. We found that TCR/CD3 crosslinking in Jurkat T cells promotes the association of Crk adaptor proteins with the transiently phosphorylated CD3ζ chain. Pull down assays using bead-immobilized GST fusion proteins revealed that the Crk-SH2 domain mediates binding of phospho-CD3ζ. Phospho-CD3ζ binding is selective and is mediated by the three types of Crk, including CrkI, CrkII, and CrkL, but not by other SH2 domain-containing adaptor proteins, such as Grb2, GRAP and Nck. Crk interaction with phospho-CD3ζ is rapid and transient, peaking 1 min post TCR/CD3 crosslinking. The results suggest the involvement of Crk adaptor proteins in the early stages of T cell activation in which Crk might help recruiting effector proteins to the vicinity of the phospho-CD3ζ and contribute to the fine-tuning of the TCR/CD3-coupled signal transduction pathways.