Triclem：高精度、室温クレムと凍結蛍光顕微鏡を組み合わせて、非常にまれなイベントを特定します

高圧凍結および樹脂包埋サンプルからの蛍光および電子顕微鏡データの法律ベースの相関により、細胞内の超微細構造への蛍光シグナルの高精度の局在化が可能になります。ここでは、高精度相関のために非常にまれなイベントの識別を促進するために、Triclem手順を紹介します。凍結蛍光顕微鏡による非常にまれな信号のために、サファイアディスクの高圧凍結細胞単層をスクリーニングするための詳細なプロトコルを提示し、凍結置換と低リクリル埋め込みの後に目的の細胞を移動し、同定された蛍光シグナルのフィダリアスベースの相関を実行します。マイトファジーの開始に関与するタンパク質であるパー​​キンの存在によってマークされたミトコンドリアを局在化および画像化するためのプロトコルの適用性を示します。以前に公開されたFiducialベースの相関手順へのこの拡張は、非常にまれなイベントを特定し、高圧凍結サンプルの保存の質を評価できる可能性がある可能性を説明します。

Fiducial-based correlation of fluorescence and electron microscopy data from high-pressure frozen and resin-embedded samples allows for high-precision localization of fluorescent signals to subcellular ultrastructure. Here we introduce the triCLEM procedure to facilitate the identification of very rare events for high-precision correlation. We present a detailed protocol to screen high-pressure frozen cell monolayers on sapphire disks for very rare signals by cryo-fluorescence microscopy, relocate the cells of interest after freeze substitution and Lowicryl embedding, and perform fiducial-based correlation of the identified fluorescent signals to high-magnification electron tomograms. We show the applicability of the protocol to localize and image damaged mitochondria marked by the presence of Parkin, a protein involved in initiating mitophagy. We discuss how this extension to previously published fiducial-based correlation procedures has potential to both allow identifying very rare events and assess the quality of preservation in high-pressure frozen samples.