タンパク質の還元とアルキル化の体系的な評価は、ヨウ素を含む試薬による大規模な非特異的副作用を明らかにしています

システイン残基の還元とアルキル化は、実質的にすべてのプロテオミクスワークフローの一部です。頻繁に使用するにもかかわらず、プロテオミクス研究の結果に対するさまざまな条件の影響に関する体系的な調査は実施されていません。この研究では、共通還元試薬（ジチオトレイトール、トリス - （2-カルボキシエチル） - ホスフィン、およびβ-メルカプトエタノール）とアルキル化試薬（ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、アクリラミド、クロロアセトアミド）を比較しました。ヘラ細胞のサイトゾル画分のSAX分画インソリューションダイジェストと同様に、ゲル内ダイジェストを使用して、13の異なる還元条件とアルキル化条件を評価し、その結果、識別率がかなり変化しました。7アミノ酸とペプチドN末端でのオフサイトのアルキル化反応に大きな違いが観察され、すべての試薬の単一および二重付加物が識別されました。ジメチル標識、質量耐性検索、および合成ペプチド実験を使用して、違いの主要な要因の1つとして、ヨウ素含有アルキル化試薬によるメチオニン残基のアルキル化を特定しました。同定されたメチオニン含有ペプチドスペクトルマッチの数に9倍以上の違いが観察されました。これは、カルバミドメチル化およびカルボキシメチル化メチオニン側鎖の形成と、エシオイオン化またはMS/MS断片化中の顕著な中性損失が原因であり、メチオニン含有ペプチドの同定率を大幅に減少させたためです。アルキル化試薬としてのアクリルアミドで最良の結果を達成しましたが、それぞれインソースとゲル内の消化サンプルでジチオトレイトールとβ-メルカプトエタノールで減少すると、最も多くのペプチドスペクトルマッチが得られました。

Reduction and alkylation of cysteine residues is part of virtually any proteomics workflow. Despite its frequent use, up to date no systematic investigation of the impact of different conditions on the outcome of proteomics studies has been performed. In this study, we compared common reduction reagents (dithiothreitol, tris-(2-carboxyethyl)-phosphine, and β-mercaptoethanol) and alkylation reagents (iodoacetamide, iodoacetic acid, acrylamide, and chloroacetamide). Using in-gel digests as well as SAX fractionated in-solution digests of cytosolic fractions of HeLa cells, we evaluated 13 different reduction and alkylation conditions resulting in considerably varying identification rates. We observed strong differences in offsite alkylation reactions at 7 amino acids as well as at the peptide N terminus, identifying single and double adducts of all reagents. Using dimethyl labeling, mass tolerant searches, and synthetic peptide experiments, we identified alkylation of methionine residues by iodine-containing alkylation reagents as one of the major factors for the differences. We observed differences of more than 9-fold in numbers of identified methionine-containing peptide spectral matches for in-gel digested samples between iodine- and noniodine-containing alkylation reagents. This was because of formation of carbamidomethylated and carboxymethylated methionine side chains and a resulting prominent neutral loss during ESI ionization or in MS/MS fragmentation, strongly decreasing identification rates of methionine-containing peptides. We achieved best results with acrylamide as alkylation reagent, whereas the highest numbers of peptide spectral matches were obtained when reducing with dithiothreitol and β-mercaptoethanol for the in-solution and the in-gel digested samples, respectively.