リアルタイムPCRおよびループを介した等温増幅（LAMP）アッセイの開発デジタル皮膚炎に関連するトレポネムの微分検出のためのアッセイ

ウシデジタル皮膚炎（DD）は、世界中の牛のla剤の重度の感染性の原因であり、重要な経済的および福祉の影響を及ぼします。DDで重要な原因の役割を果たすことに関与する3つのTreponeme Phylopuns（T。Pedis、T。Phagedenis、およびT. Medium）があります。この研究は、DDに関連する3つのTreponeme Phylogroupsの検出と分化のためのリアルタイムPCRおよびループ媒介等温増幅（LAMP）アッセイを開発するために実施されました。リアルタイムPCR Treponeme Phylogroupアッセイは、T。PedisおよびT. Phagedenisの16S-23S RDNA間空間（ITS）、およびT.培地のフラジェリン遺伝子（FLAB2）を標的としました。3つのTreponeme Phylogroup Lampアッセイは、フラジェリン遺伝子（FLAB2）を標的とし、16S rRNAはTreponeme SSPの標的でした。ランプアッセイ。リアルタイムPCRおよびランプアッセイは、調査したすべてのコントロール株のターゲット配列を正しく検出し、100％の特異性を表す交差反応は観察されませんでした。3つのTreponeme PhylogroupリアルタイムPCRおよびランプアッセイのそれぞれの検出限界は、70 fg/μl以下でした。Treponema sppの検出限界。ランプアッセイは、植物団に応じて7-690 FG/μLの範囲でした。免疫磁気分離培養法を使用して、40のDD病変生検からTreponemeを分離しました。次に、Treponeme分離サンプルを、分析のためにリアルタイムPCRおよびLAMPアッセイにかけました。Treponeme PhylogroupリアルタイムPCRおよびランプアッセイの結果は、すべての分離サンプルで一致し、100％の一致を示しました。これらの結果は、開発されたアッセイが、DDに関与する3つの主要なTreponeme Phylogroupの検出と分化のための敏感で特異的なテストであることを示しています。

Bovine digital dermatitis (DD) is a severe infectious cause of lameness in cattle worldwide, with important economic and welfare consequences. There are three treponeme phylogroups (T. pedis, T. phagedenis, and T. medium) that are implicated in playing an important causative role in DD. This study was conducted to develop real-time PCR and loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the detection and differentiation of the three treponeme phylogroups associated with DD. The real-time PCR treponeme phylogroup assays targeted the 16S-23S rDNA intergenic space (ITS) for T. pedis and T. phagedenis, and the flagellin gene (flaB2) for T. medium. The 3 treponeme phylogroup LAMP assays targeted the flagellin gene (flaB2) and the 16S rRNA was targeted for the Treponeme ssp. LAMP assay. The real-time PCR and LAMP assays correctly detected the target sequence of all control strains examined, and no cross-reactions were observed, representing 100% specificity. The limit of detection for each of the three treponeme phylogroup real-time PCR and LAMP assays was ≤ 70 fg/μl. The detection limit for the Treponema spp. LAMP assay ranged from 7-690 fg/μl depending on phylogroup. Treponemes were isolated from 40 DD lesion biopsies using an immunomagnetic separation culture method. The treponeme isolation samples were then subjected to the real-time PCR and LAMP assays for analysis. The treponeme phylogroup real-time PCR and LAMP assay results had 100% agreement, matching on all isolation samples. These results indicate that the developed assays are a sensitive and specific test for the detection and differentiation of the three main treponeme phylogroups implicated in DD.