細胞外熱ショックタンパク質90αは、RhoA/MLCシグナル伝達を活性化することにより、HDM誘発性気管支上皮バリア機能障害を媒介します

背景：気管支上皮の障壁の破壊と過経験性は、喘息の病因と密接に関連しています。最も重要なアレルゲンの1つであるハウスダストダニ（HDM）は、気道上皮透過性を高める可能性があります。熱ショックタンパク質（HSP）90αは、RHOAシグナル伝達を破壊することにより、肺内皮バリア機能障害にも関与しています。しかし、HDMによって誘発される気管支上皮バリアの破壊に対する細胞外HSP90α（EHSP90α）の効果は報告されていません。 方法：HDMによって誘発された気管支上皮バリアの破壊におけるEHSP90αの関与を調査するために、正常なヒト気管支上皮細胞株16HBE14O-（16HBE）細胞は、HDM、ヒト再生剤（HR）HSP90αおよびHRHSSP90βによって処理されました。特定の抗秘密HSP90αモノクローナル抗体（MAB）。HSP90αサイレンシング細胞も構築されました。このプロセスにおけるRhoAシグナル伝達の役割をさらに評価するために、細胞はRhoキナーゼ、GSK429286AおよびY27632 2HCLの阻害剤によって前処理されました。上皮障壁機能として、鎖骨骨の電気抵抗（TEER）およびFITC-DEXTRANフラックス（FITC-DX）を調べました。接着接合タンパク質E-カドヘリンとβ-カテニンの発現と局在は、それぞれウエスタンブロッティングと免疫蛍光により評価されました。EHSP90αのレベルは、状態媒体の濃度と精製により調査されました。RhoA活性は、Rho g-lisa®RhoA活性化アッセイKittM Biochem Kitを使用して決定され、RhoAの下流のシグナル分子であるミオシン軽鎖（MLC）のリン酸化がウエスタンブロッティングによって評価されました。 結果：細胞膜における上皮バリアの破壊と接着接合タンパク質E-カドヘリンとβ-カテニンの喪失は、HDM処理された16HBE細胞で観察され、EHSP90α分泌の増加と並行しています。これらはすべて、HSP90αサイレンシング細胞または1G6-D7で16HBE細胞を前処理することにより救助されました。また、1G6-D7はRhoA活性とHDMによって誘導されるMLCリン酸化を抑制しました。さらに、Rhoキナーゼの阻害剤は、気道障壁の破壊を予防し、回復しました。一貫して、バリア機能障害を促進し、16HBE細胞でRHOA/MLCシグナル伝達を活性化したのは、HRHSP90βの代わりにHRHSP90αでした。 結論：EHSP90αは、RhoA/MLCシグナル伝達を活性化することによりHDM誘発性のヒト気管支上皮バリア機能障害を媒介し、EHSP90αが喘息の治療の潜在的な治療標的であることを示唆しています。

BACKGROUND: The disruption and hyperpermeability of bronchial epithelial barrier are closely related to the pathogenesis of asthma. House dust mite (HDM), one of the most important allergens, could increase the airway epithelial permeability. Heat shock protein (Hsp) 90α is also implicated in the lung endothelial barrier dysfunction by disrupting RhoA signaling. However, the effect of extracellular Hsp90α (eHsp90α) on the bronchial epithelial barrier disruption induced by HDM has never been reported. METHODS: To investigate the involvement of eHsp90α in the bronchial epithelial barrier disruption induced by HDM, normal human bronchial epithelial cell line 16HBE14o- (16HBE) cells were treated by HDM, human recombinant (hr) Hsp90α and hrHsp90β respectively and pretreated by1G6-D7, a specific anti-secreted Hsp90α monoclonal antibody (mAb). Hsp90α-silencing cells were also constructed. To further evaluate the role of RhoA signaling in this process, cells were pretreated by inhibitors of Rho kinase, GSK429286A and Y27632 2HCl. Transepithelial electrical resistance (TEER) and FITC-dextran flux (FITC-DX) were examined as the epithelial barrier function. Expression and localization of adherens junctional proteins E-cadherin and β-catenin were evaluated by western blotting and immunofluorescence respectively. The level of eHsp90α was investigated by concentration and purification of condition media. RhoA activity was determined by using a Rho G-LISA® RhoA activation assay kitTM biochem kit, and the phosphorylation of myosin light chain (MLC), the downstream signal molecule of RhoA, was assessed by western blotting. RESULTS: The epithelial barrier disruption and the loss of adherens junctional proteins E-cadherin and β-catenin in cytomembrane were observed in HDM-treated 16HBE cells, paralleled with the increase of eHsp90α secretion. All of which were rescued in Hsp90α-silencing cells or by pretreating 16HBE cells with 1G6-D7. Also, 1G6-D7 suppressed RhoA activity and MLC phosphorylation induced by HDM. Furthermore, inhibitors of Rho kinase prevented and restored the airway barrier disruption. Consistently, it was hrHsp90α instead of hrHsp90β that promoted barrier dysfunction and activated RhoA/MLC signaling in 16HBE cells. CONCLUSIONS: The eHsp90α mediates HDM-induced human bronchial epithelial barrier dysfunction by activating RhoA/MLC signaling, suggesting that eHsp90α is a potential therapeutic target for treatment of asthma.