空間的に調節されたヒト好中球エラスターゼのパウクマノースが豊富なN-グリコシル化は、その免疫機能を調節する

ヒト好中球エラスターゼ（HNE）は、自然免疫系で重要なN-グリコシル化セリンプロテアーゼですが、HNE N-グリコシル化の構造と免疫調節機能は記載されていません。ここでは、LC-MS/MSベースのグリカン、グリコペプチド、グリコタンパク質プロファイリングを利用して、最初に好中球溶解物から精製し、次に健康な人の分離好中球顆粒から精製されたHNEの不均一なN-グリコシル化を決定しました。好中球の活性化中のHNEの時空間発現とそのN-グリコシル化の生物学的重要性も、免疫ブロッティング、細胞表面捕獲、ネイティブMS、受容体相互作用、プロテアーゼ阻害、および細菌成長アッセイを使用して調査されました。部位固有のglycoprofilingは、主にASN124およびASN173を占有している、異常なパクティマンノシドN-グリカン、特にMANα1,6MANβ1,4GLCNAcβ1,4,4,4,4,4,4,4,4,4,4,4,4,4,4,4,4,4,4,4,4,3.同様に珍しいコアフコシル化モノアンテンナ複合体型N-サリログリカンも、これら2つの完全に占有されたサイトを装飾しました。対照的に、ほとんど占有されていないASN88は、おそらく低グリコシル化部位の溶媒のアクセシビリティに起因する非フコシル化パクマンノシドN-グリカンを運びました。ASN185はグリコシル化されていませんでした。細胞内および部位固有の糖孔固定は、異なる好中球コンパートメントに存在するHNEの非常に均一なN-グリコシル化を示しました。刺激によって誘発される細胞表面の動員は、活性化されたヒト好中球におけるHNEの時空間的調節を示したが、細胞表面特異的なグリコシル化シグネチャではなかった。HNEの3つのグリコシル化部位は、HNE酵素活性との干渉以外のグリカン機能を示す活性部位の遠位に位置していました。機能的には、パクマンノシドhneグリコフォームは、補体活性化におけるグリコフォーム依存性のHNE依存性の関与を示唆していることを示唆していることを示唆しています。重度のN-グリコシル化HNEプロテアーゼ阻害剤であるα1-アンチトリプシンは、濃度依存性複合体形成を示し、HNEとのグリコフォーム - グリコフォームの相互作用を好む。最後に、酵素的に活性なHNEと分離されたHNE N-Glycansの両方が、臨床的に関連性のあるシュードモナス緑膿菌の低ミクロモル濃度依存性成長阻害を実証し、いくつかの細菌活性がHNE N-Glycansによって授与されることを示唆しています。まとめると、これらの観察結果は、ここで初めて報告された異常なHNE N-グリコシル化が、炎症と感染の中心的な複数の免疫機能の調節に関与していることを支持しています。

Human neutrophil elastase (HNE) is an important N-glycosylated serine protease in the innate immune system, but the structure and immune-modulating functions of HNE N-glycosylation remain undescribed. Herein, LC-MS/MS-based glycan, glycopeptide and glycoprotein profiling were utilized to first determine the heterogeneous N-glycosylation of HNE purified from neutrophil lysates and then from isolated neutrophil granules of healthy individuals. The spatiotemporal expression of HNE during neutrophil activation and the biological importance of its N-glycosylation were also investigated using immunoblotting, cell surface capture, native MS, receptor interaction, protease inhibition, and bacteria growth assays. Site-specific HNE glycoprofiling demonstrated that unusual paucimannosidic N-glycans, particularly Manα1,6Manβ1,4GlcNAcβ1,4(Fucα1,6)GlcNAcβ, predominantly occupied Asn124 and Asn173. The equally unusual core fucosylated monoantenna complex-type N-sialoglycans also decorated these two fully occupied sites. In contrast, the mostly unoccupied Asn88 carried nonfucosylated paucimannosidic N-glycans probably resulting from low glycosylation site solvent accessibility. Asn185 was not glycosylated. Subcellular- and site-specific glycoprofiling showed highly uniform N-glycosylation of HNE residing in distinct neutrophil compartments. Stimulation-induced cell surface mobilization demonstrated a spatiotemporal regulation, but not cell surface-specific glycosylation signatures, of HNE in activated human neutrophils. The three glycosylation sites of HNE were located distal to the active site indicating glycan functions other than interference with HNE enzyme activity. Functionally, the paucimannosidic HNE glycoforms displayed preferential binding to human mannose binding lectin compared with the HNE sialoglycoforms, suggesting a glycoform-dependent involvement of HNE in complement activation. The heavily N-glycosylated HNE protease inhibitor, α1-antitrypsin, displayed concentration-dependent complex formation and preferred glycoform-glycoform interactions with HNE. Finally, both enzymatically active HNE and isolated HNE N-glycans demonstrated low micromolar concentration-dependent growth inhibition of clinically-relevant Pseudomonas aeruginosa, suggesting some bacteriostatic activity is conferred by the HNE N-glycans. Taken together, these observations support that the unusual HNE N-glycosylation, here reported for the first time, is involved in modulating multiple immune functions central to inflammation and infection.