方向性因子との融合によるセリンインテグレーゼ組換え方向性の制御

バクテリオファージセリンインテグラゼは、DNA配列の組み立ておよび再配列のために、バイオテクノロジーおよび合成生物学で広く使用されています。セリンインテグレーゼは、2つの異なるDNA部位、ATTPとATTB間の組換えを促進し、組換えATTLおよび属性部位を形成します。「逆」反応には、インテグレーゼに加えて、組換え方向性係数（RDF）と呼ばれる別のファージエンコードタンパク質が必要です。RDFはATTL×attrの組換えを活性化し、ATTP×ATTBの組換えを阻害します。ここでは、セリンインテグレーゼを同族RDFに融合して、in vivoおよびin vitroで効率的なATTL×attrの再結合を触媒する単一タンパク質を作成できるのに対し、ATTP×ATTB組換え効率が低下することを示しています。ATTL×attrの組換えの活性化には、融合タンパク質のインテグラゼおよびRDF部分の間のサブユニット内接触が含まれるという証拠を提供します。Integrase-RDFリンカーペプチドの長さと配列のわずかな変化は、融合タンパク質組換え活性に影響しませんでした。Integrase-RDF融合タンパク質の効率と単一タンパク質の利便性により、バイオテクノロジー/合成生物学のアプリケーションにとって非常に有利になります。ここでは、原理の証明として合成代謝経路遺伝子アレイにおける効率的な遺伝子カセット置換を示します。

Bacteriophage serine integrases are extensively used in biotechnology and synthetic biology for assembly and rearrangement of DNA sequences. Serine integrases promote recombination between two different DNA sites, attP and attB, to form recombinant attL and attR sites. The 'reverse' reaction requires another phage-encoded protein called the recombination directionality factor (RDF) in addition to integrase; RDF activates attL × attR recombination and inhibits attP × attB recombination. We show here that serine integrases can be fused to their cognate RDFs to create single proteins that catalyse efficient attL × attR recombination in vivo and in vitro, whereas attP × attB recombination efficiency is reduced. We provide evidence that activation of attL × attR recombination involves intra-subunit contacts between the integrase and RDF moieties of the fusion protein. Minor changes in the length and sequence of the integrase-RDF linker peptide did not affect fusion protein recombination activity. The efficiency and single-protein convenience of integrase-RDF fusion proteins make them potentially very advantageous for biotechnology/synthetic biology applications. Here, we demonstrate efficient gene cassette replacement in a synthetic metabolic pathway gene array as a proof of principle.