ヒトアクアポリン2（AQP2）のリン酸化は、リソソーム輸送タンパク質LIP5との相互作用をアロステリックに制御します

腎水チャネルアクアポリン-2（AQP2）とリソソーム輸送レギュレーターの相互作用タンパク質LIP5との相互作用は、AQP2を多核体に標的とし、リソソーム分解を促進します。この相互作用は、AQP2頂端膜の存在量をバソプレシン依存的に制御するプロセスの一部であり、尿量調整を可能にします。バソプレシンは、AQP2 C末端（Ser256、Ser261、Ser264、およびThr269）内の4つの部位でリン酸化を調節し、そのうちSer256は貯蔵小胞から頂端膜へのAQP2転座に十分です。ただし、AQP2リン酸化がAQP2-LIP5複合体の親和性を調節するかどうかは不明です。ここでは、AQP2がリン酸化依存的にLIP5を結合することを示すために、遠心のブロット分析とマイクロスケールの熱恐怖症を使用しました。5つのホスホミミック変異体（S256E、S261E、S264E、T269E、およびS256E/T269E）と、すべてのリン酸化部位を欠いていたが、以前に示唆されたLIP5バインディング部位を返済したC末端トランケーション変異体（ΔP242）を構築しました。CD分光法は、野生型AQP2とリン模様を模倣する変異体の全体的な構造が類似しているが、C末端の立体構造の変化から生じる可能性のある融解温度の違いを示すことを示した。AQP2-ΔP242は、リン酸化されていないAQP2結合LIP5を最も高い親和性で結合しましたが、AQP2-ΔP242はマイクロスケールの熱焦点によって決定されたように20倍低い親和性を持っていました。AQP2-S256E、S261E、T269E、およびS256E/T269Eはすべて親和性が低下しました。この効果は、AQP2-S256Eで最も顕著であり、頂端膜ターゲティングにおける役割によく適合しています。AQP2-S264Eは、非リン酸化AQP2と同様の親和性を示し、おそらくエキソソーム排泄における役割を示しています。我々のデータは、AQP2リン酸化がLIP5との相互作用をアロステリックに制御し、相互作用するタンパク質への親和性の変化が、翻訳後修飾によるAQP2人身売買の調節の基礎をどのように形成するかを示すことを示唆しています。

The interaction between the renal water channel aquaporin-2 (AQP2) and the lysosomal trafficking regulator-interacting protein LIP5 targets AQP2 to multivesicular bodies and facilitates lysosomal degradation. This interaction is part of a process that controls AQP2 apical membrane abundance in a vasopressin-dependent manner, allowing for urine volume adjustment. Vasopressin regulates phosphorylation at four sites within the AQP2 C terminus (Ser256, Ser261, Ser264, and Thr269), of which Ser256 is crucial and sufficient for AQP2 translocation from storage vesicles to the apical membrane. However, whether AQP2 phosphorylation modulates AQP2-LIP5 complex affinity is unknown. Here we used far-Western blot analysis and microscale thermophoresis to show that the AQP2 binds LIP5 in a phosphorylation-dependent manner. We constructed five phospho-mimicking mutants (S256E, S261E, S264E, T269E, and S256E/T269E) and a C-terminal truncation mutant (ΔP242) that lacked all phosphorylation sites but retained a previously suggested LIP5-binding site. CD spectroscopy indicated that wild-type AQP2 and the phospho-mimicking mutants had similar overall structure but displayed differences in melting temperatures possibly arising from C-terminal conformational changes. Non-phosphorylated AQP2 bound LIP5 with the highest affinity, whereas AQP2-ΔP242 had 20-fold lower affinity as determined by microscale thermophoresis. AQP2-S256E, S261E, T269E, and S256E/T269E all had reduced affinity. This effect was most prominent for AQP2-S256E, which fits well with its role in apical membrane targeting. AQP2-S264E had affinity similar to non-phosphorylated AQP2, possibly indicating a role in exosome excretion. Our data suggest that AQP2 phosphorylation allosterically controls its interaction with LIP5, illustrating how altered affinities to interacting proteins form the basis for regulation of AQP2 trafficking by post-translational modifications.