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細胞外小胞（EV）は、自然な組成のために核酸送達の新しいシステムとして大きな可能性を秘めています。私たちの目標は、EVにEVSをMicroRNAにロードすることでした。これは、EVを生成する細胞によって合成されます。HEK293T細胞は、リソソーム関連膜であるLAMP2A融合タンパク質を発現するEVを産生するように設計されました。Pre-MIR-199Aをコードする遺伝子は、LAMP2A融合タンパク質の人工イントロンに挿入されました。TATペプチド/HIV-1トランス活性化応答（TAR）RNA相互作用ペプチドを悪用して、修正されたTAR RNAループを含むPre-MIR-199AのEV負荷を強化しました。計算モデリングは、修正されたPre-MIR-199AループとTATペプチドの間の安定した相互作用を実証しました。EMSAゲルシフト、組換えダイサー処理、およびルシフェラーゼ結合アッセイにより、修正されたPre-MIR-199Aの結合、処理、および機能が確認されました。TAT-TAR相互作用により、miR-199AのEVへの負荷が65倍増加しました。内生的に負荷のあるEVは、レシピエントSK-HEP1細胞に活性miR-199A-3p治療薬を送達するのに効果がありませんでした。このアプローチを通じてEVへの低いmiRNA負荷がレシピエント細胞にRNA貨物を非効率的に分布させることになりましたが、EVにmiRNAをロードするTAT TAR戦略は、miRNA模倣またはRNAを含む他のヘアピンを含む他の薬物送達アプローチで価値がある場合があります。
細胞外小胞（EV）は、自然な組成のために核酸送達の新しいシステムとして大きな可能性を秘めています。私たちの目標は、EVにEVSをMicroRNAにロードすることでした。これは、EVを生成する細胞によって合成されます。HEK293T細胞は、リソソーム関連膜であるLAMP2A融合タンパク質を発現するEVを産生するように設計されました。Pre-MIR-199Aをコードする遺伝子は、LAMP2A融合タンパク質の人工イントロンに挿入されました。TATペプチド/HIV-1トランス活性化応答（TAR）RNA相互作用ペプチドを悪用して、修正されたTAR RNAループを含むPre-MIR-199AのEV負荷を強化しました。計算モデリングは、修正されたPre-MIR-199AループとTATペプチドの間の安定した相互作用を実証しました。EMSAゲルシフト、組換えダイサー処理、およびルシフェラーゼ結合アッセイにより、修正されたPre-MIR-199Aの結合、処理、および機能が確認されました。TAT-TAR相互作用により、miR-199AのEVへの負荷が65倍増加しました。内生的に負荷のあるEVは、レシピエントSK-HEP1細胞に活性miR-199A-3p治療薬を送達するのに効果がありませんでした。このアプローチを通じてEVへの低いmiRNA負荷がレシピエント細胞にRNA貨物を非効率的に分布させることになりましたが、EVにmiRNAをロードするTAT TAR戦略は、miRNA模倣またはRNAを含む他のヘアピンを含む他の薬物送達アプローチで価値がある場合があります。
Extracellular vesicles (EVs) hold great potential as novel systems for nucleic acid delivery due to their natural composition. Our goal was to load EVs with microRNA that are synthesized by the cells that produce the EVs. HEK293T cells were engineered to produce EVs expressing a lysosomal associated membrane, Lamp2a fusion protein. The gene encoding pre-miR-199a was inserted into an artificial intron of the Lamp2a fusion protein. The TAT peptide/HIV-1 transactivation response (TAR) RNA interacting peptide was exploited to enhance the EV loading of the pre-miR-199a containing a modified TAR RNA loop. Computational modeling demonstrated a stable interaction between the modified pre-miR-199a loop and TAT peptide. EMSA gel shift, recombinant Dicer processing and luciferase binding assays confirmed the binding, processing and functionality of the modified pre-miR-199a. The TAT-TAR interaction enhanced the loading of the miR-199a into EVs by 65-fold. Endogenously loaded EVs were ineffective at delivering active miR-199a-3p therapeutic to recipient SK-Hep1 cells. While the low degree of miRNA loading into EVs through this approach resulted in inefficient distribution of RNA cargo into recipient cells, the TAT TAR strategy to load miRNA into EVs may be valuable in other drug delivery approaches involving miRNA mimics or other hairpin containing RNAs.
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