DAP-seqを使用したゲノム全体の転写因子結合部位のマッピング

あらゆる生物のシストロームおよびエピシストロームマップの低コストでハイスループット生成を可能にするために、我々は、カップル親和性給与を受けた転写因子（TF）結合部位（TFBS）発見アッセイであるDNA親和性精製シーケンス（DAP-Seq）を開発しました。ゲノムDNAライブラリの次世代シーケンスを備えたTFS。この方法は、クロマチン免疫沈降シーケンス（CHIP-seq）よりも高速で安価で、より簡単にスケーリングされます。DNAライブラリは、TF結合（DNAメチル化など）に影響することが知られている細胞および組織特異的化学修飾を保存し、モチーフからのモチーフに基づくINシリコ予測と比較して特異性を増加させることが知られている、任意の関心源からのネイティブゲノムDNAを使用して構築されます。タンパク質結合マイクロアレイ（PBM）や指数濃縮によるリガンドの系統的進化（SELEX）などの方法。得られたDNAライブラリーは、アフィニティタグ付きでin vitro発現TFでインキュベートされ、TF-DNA複合体はアフィニティタグの磁気分離を使用して精製されます。結合したゲノムDNAはTFから溶出され、次世代シーケンスを使用してシーケンスされます。シーケンス読み取りは参照ゲノムにマッピングされ、各TFアッセイのゲノム全体の結合位置を識別し、そこからシーケンスモチーフを導き出すことができます。分子生物学の経験を持つ研究者は、このプロトコルに従い、週に最大400個のサンプルを処理できる必要があります。

To enable low-cost, high-throughput generation of cistrome and epicistrome maps for any organism, we developed DNA affinity purification sequencing (DAP-seq), a transcription factor (TF)-binding site (TFBS) discovery assay that couples affinity-purified TFs with next-generation sequencing of a genomic DNA library. The method is fast, inexpensive, and more easily scaled than chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq). DNA libraries are constructed using native genomic DNA from any source of interest, preserving cell- and tissue-specific chemical modifications that are known to affect TF binding (such as DNA methylation) and providing increased specificity as compared with in silico predictions based on motifs from methods such as protein-binding microarrays (PBMs) and systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). The resulting DNA library is incubated with an affinity-tagged in vitro-expressed TF, and TF-DNA complexes are purified using magnetic separation of the affinity tag. Bound genomic DNA is eluted from the TF and sequenced using next-generation sequencing. Sequence reads are mapped to a reference genome, identifying genome-wide binding locations for each TF assayed, from which sequence motifs can then be derived. A researcher with molecular biology experience should be able to follow this protocol, processing up to 400 samples per week.