Bacillus subtilisのIPTG誘導性プロモーターに基づく誘導性発現プラスミドの開発

背景：大腸菌大腸菌に加えて、亜種は組換えタンパク質の産生にとって重要な細菌種です。組換え遺伝子は、大腸菌と亜種の両方で複製するシャトル発現ベクターに挿入されます。ライゲーション産物は最初に大腸菌細胞に変換され、正しい挿入のために分析され、正しい組換えプラスミドがB. subtilisに変換されます。大腸菌細胞を使用した主要な問題は、組換えタンパク質の強力な基礎レベルの発現レベルであり、細胞の安定性を妨げる可能性があります。この問題を最小限に抑えるために、大腸菌では抑制されている強力な発現ベクターを開発し、B。subtilisで誘導しませんでした。 結果：一般に、IPTG誘導性発現ベクターの誘導は、プロモーター上のLACOオペレーターと組み合わせてLACIリプレッサーをコードする調節LACI遺伝子によって決定されます。ベクターの誘導性のない特性を調査するために、LACI遺伝子を除去することにより、インデューサーのない発現プラスミドを構築し、その特性を特徴付けました。最初に、標的遺伝子を運ぶ発現ベクターの構築を促進する顕著な特性である大腸菌のレポーター遺伝子を抑制する能力を調べました。PGRAC01-BGABから発現したβ-ガラクトシダーゼ（BGAB遺伝子）基礎レベルは、大腸菌クローニング株で少なくとも2回抑制される可能性があります。第二に、B。subtilisのPGRAC01プロモーターを使用した4つの異なるプラスミドからのBGABの誘導を含まない産生を調査しました。予想どおり、インデューサーを含まないコンストラクトのBGAB発現レベルは、IPTGの非存在下で誘導性コンストラクトのそれよりも少なくとも37倍高く、インデューサーの存在下での誘導コンストラクトのそれに匹敵します。第三に、強力なプロモーターPGRAC100を含む効率的なIPTG誘導性発現ベクターを使用して、それらをインデューサーフリーの発現プラスミドに変換することができました。誘導因子の非存在下での誘導性プラスミドからのBGAB産生レベルは、同じプロモーターを使用した誘導性ベクターのそれよりも少なくとも4.5倍高かった。最後に、GFPを2つのプロモーターPGRAC01およびPGRAC100と組み合わせてレポーター遺伝子として使用して、新しいベクトルタイプをテストしました。GFP発現レベルは、大腸菌のPGRAC01-GFP+インデューサーフリーコンストラクトで少なくとも1.5倍抑制される可能性があります。インデューサーフリーコンストラクトは、PGRAC01-GFP+およびPGRAC100-GFP+が、23×104から32×104 RFUユニット、および総細胞内タンパク質の9〜13％の高レベルでGFP発現を許可しました。新しい誘導性発現プラスミドの2つの主要な利点を再構成することができます：（1）大腸菌クローニング株における標的遺伝子発現の強い抑制、および（2）B。subtilisの高レベルでの標的タンパク質の産生インデューサーがない場合。 結論：IPTG誘導性ベクターを使用してインデューサーフリーの発現ベクターを生成する一般的な戦略を提案し、より具体的には、LACI抑制因子の非存在下でIPTG誘導性プロモーターを使用してインデューサーフリーの発現プラスミドを開発しました。これらのプラスミドは、誘導因子を添加せずに、亜亜種の組換えタンパク質の高レベルの産生と同時に、大腸菌の組換えタンパク質の低い基底レベルを維持するための優れた選択肢となる可能性があります。組換え遺伝子発現の抑制は、大腸菌クローニング株の成長を潜在的に阻害する遺伝子のクローニングを促進します。インデューサーフリーの発現プラスミドは、B。subtilisの現在利用可能なIPTG誘導性発現ベクターの拡張バージョンになります。これらの誘導剤を含まず、以前に開発されたIPTG誘導性発現プラスミドは、組換えタンパク質の産生のために小規模で大規模に遺伝子発現を研究するのに役立つカセットになります。

BACKGROUND: Besides Escherichia coli, Bacillus subtilis is an important bacterial species for the production of recombinant proteins. Recombinant genes are inserted into shuttle expression vectors which replicate in both E. coli and in B. subtilis. The ligation products are first transformed into E. coli cells, analyzed for correct insertions, and the correct recombinant plasmids are then transformed into B. subtilis. A major problem using E. coli cells can be the strong basal level of expression of the recombinant protein which may interfere with the stability of the cells. To minimize this problem, we developed strong expression vectors being repressed in E. coli and inducer-free in B. subtilis. RESULTS: In general, induction of IPTG-inducible expression vectors is determined by the regulatory lacI gene encoding the LacI repressor in combination with the lacO operator on the promoter. To investigate the inducer-free properties of the vectors, we constructed inducer-free expression plasmids by removing the lacI gene and characterized their properties. First, we examined the ability to repress a reporter gene in E. coli, which is a prominent property facilitating the construction of the expression vectors carrying a target gene. The β-galactosidase (bgaB gene) basal levels expressed from Pgrac01-bgaB could be repressed at least twice in the E. coli cloning strain. Second, the inducer-free production of BgaB from four different plasmids with the Pgrac01 promoter in B. subtilis was investigated. As expected, BgaB expression levels of inducer-free constructs are at least 37 times higher than that of the inducible constructs in the absence of IPTG, and comparable to those in the presence of the inducer. Third, using efficient IPTG-inducible expression vectors containing the strong promoter Pgrac100, we could convert them into inducer-free expression plasmids. The BgaB production levels from the inducer-free plasmid in the absence of the inducer were at least 4.5 times higher than that of the inducible vector using the same promoter. Finally, we used gfp as a reporter gene in combination with the two promoters Pgrac01 and Pgrac100 to test the new vector types. The GFP expression levels could be repressed at least 1.5 times for the Pgrac01-gfp+ inducer-free construct in E. coli. The inducer-free constructs Pgrac01-gfp+ and Pgrac100-gfp+ allowed GFP expression at high levels from 23 × 104 to 32 × 104 RFU units and 9-13% of total intracellular proteins. We could reconfirm the two major advantages of the new inducer-free expression plasmids: (1) Strong repression of the target gene expression in the E. coli cloning strain, and (2) production of the target protein at high levels in B. subtilis in the absence of the inducer. CONCLUSIONS: We propose a general strategy to generate inducer-free expression vector by using IPTG-inducible vectors, and more specifically we developed inducer-free expression plasmids using IPTG-inducible promoters in the absence of the LacI repressor. These plasmids could be an excellent choice for high-level production of recombinant proteins in B. subtilis without the addition of inducer and at the same time maintaining a low basal level of the recombinant proteins in E. coli. The repression of the recombinant gene expression would facilitate cloning of genes that potentially inhibit the growth of E. coli cloning strains. The inducer-free expression plasmids will be extended versions of the current available IPTG-inducible expression vectors for B. subtilis, in which all these vectors use the same cognate promoters. These inducer-free and previously developed IPTG-inducible expression plasmids will be a useful cassette to study gene expression at a small scale up to a larger scale up for the production of recombinant proteins.