2色および3色の単一分子FRETによってプローブされたp53の四量体化ドメインのオリゴマー化

2色および3色の単一分子FRET分光法と2D FRET効率標準時分析を組み合わせて、本質的に無秩序なタンパク質のオリゴマー化プロセスを調べる方法について説明します。この方法は、腫瘍抑制タンパク質P53の四量体化ドメイン（TD）のオリゴマー化に適用されます。TDは、サブナノモル濃度のモノマーとして存在し、より高い濃度で二量体と四量体を形成します。この論文で決定したように、ダイマーとテトラマーの解離定数は非常に近いため、アンサンブル法、特に容易に分離できない二量体によって異なるオリゴマー種を特徴付けることはできません。ただし、蛍光寿命の測定値と2色および3色のFRET効率を含む単一分子FRET分光法を使用して、サブミリ秒のアクセプターの点滅のための補正を伴う2色および3色のFRET効率を使用することにより、平衡状態で個々のオリゴマーの構造情報を取得し、決定することが可能であることが示され、二量体化速度論。これらの分析から、モノマーは本質的に無秩序であり、二量体の立体構造は四量体のそれと非常に類似しているが、二量体のC末端はより柔軟であることを示しています。

We describe a method that combines two- and three-color single-molecule FRET spectroscopy with 2D FRET efficiency-lifetime analysis to probe the oligomerization process of intrinsically disordered proteins. This method is applied to the oligomerization of the tetramerization domain (TD) of the tumor suppressor protein p53. TD exists as a monomer at subnanomolar concentrations and forms a dimer and a tetramer at higher concentrations. Because the dissociation constants of the dimer and tetramer are very close, as we determine in this paper, it is not possible to characterize different oligomeric species by ensemble methods, especially the dimer that cannot be readily separated. However, by using single-molecule FRET spectroscopy that includes measurements of fluorescence lifetime and two- and three-color FRET efficiencies with corrections for submillisecond acceptor blinking, we show that it is possible to obtain structural information for individual oligomers at equilibrium and to determine the dimerization kinetics. From these analyses, we show that the monomer is intrinsically disordered and that the dimer conformation is very similar to that of the tetramer but the C terminus of the dimer is more flexible.