バイオセンシングおよび分子イメージングアプリケーションの改善のために、細胞内保持ガウスルシフェラーゼ記者団

Gaussia Luciferase（Gluc）は、重要性が高まる生物発光レポータータンパク質です。分泌タンパク質として、in vitroおよびin vivo（〜20000倍、およびそれぞれ約1000倍）で競合他社であるアルカリホスファターゼを分泌した感度を高めています。残念ながら、この同じ有利なGlucの性質は、他の多くの可能な細胞内用途、たとえば無傷の細胞、in vivoイメージング、およびタンパク質タンパク質の相互作用とタンパク質折りたたみを研究する分子イメージングバイオセンサーの開発において、その有用性を制限します。したがって、Glucの研究用途を広げるために、N末端分泌信号ペプチドを変更し、C末端領域に追加の配列をタグ付けすることにより、細胞内保持を増加させる操作性バリアントを開発しました。Glucが哺乳類細胞で発現した場合、アミノ酸1〜16を含むN末端分泌性シグナルペプチドが、その固有の分泌特性に加えて、Glucの折りたたみと機能的活性に不可欠であることがわかりました。複数の反復でペプチドを標的とする4つのアミノ酸（KDEL）小胞体網状体にタグを付けることにより、GlucのC末端の修飾により、その折りたたみおよび酵素活性にほとんど影響を与えず、細胞内保持が大幅に改善されました。この操作されたglucを発現する安定した細胞をKDELリピートで使用して、化学的に誘導された小胞体ストレスを監視しました。さらに、Glucタンパク質とKDELリピートの間に4つのアミノ酸カスパーゼ基質ペプチド（DEVD）を含むGlucの修飾バリアントを使用して、アポトーシスセンサーを設計しました。細胞培養での使用は、化学療法薬ドキソルビシン、パクリタキセル、およびカルボプラチンで細胞を処理したときに、成長培地の凝集感の増加をもたらしました。したがって、細胞外で分泌されるのではなく、細胞内に保持される新しいバリアントGlucタンパク質の設計に成功しました。この新しいレポーターは、細胞小胞体ストレスとカスパーゼの活性化を検出するためにバイオセンサーに組み込むことで検証しました。この新しい分子的に操作された酵素レポーターは、生物学的研究における広範な応用の可能性があります。

Gaussia luciferase (GLUC) is a bioluminescent reporter protein of increasing importance. As a secretory protein, it has increased sensitivity in vitro and in vivo (∼20 000-fold, and ∼1000-fold, respectively) over its competitor, secreted alkaline phosphatase. Unfortunately, this same advantageous secretory nature of GLUC limits its usefulness for many other possible intracellular applications, e.g., imaging signaling pathways in intact cells, in vivo imaging, and in developing molecular imaging biosensors to study protein-protein interactions and protein folding. Hence, to widen the research applications of GLUC, we developed engineered variants that increase its intracellular retention both by modifying the N-terminal secretory signal peptide and by tagging additional sequences to its C-terminal region. We found that when GLUC was expressed in mammalian cells, its N-terminal secretory signal peptide comprising amino acids 1-16 was essential for GLUC folding and functional activity in addition to its inherent secretory property. Modification of the C-terminus of GLUC by tagging a four amino acid (KDEL) endoplasmic reticulum targeting peptide in multiple repeats significantly improved its intracellular retention, with little impact on its folding and enzymatic activity. We used stable cells expressing this engineered GLUC with KDEL repeats to monitor chemically induced endoplasmic reticulum stress on cells. Additionally, we engineered an apoptotic sensor using modified variants of GLUC containing a four amino acid caspase substrate peptide (DEVD) between the GLUC protein and the KDEL repeats. Its use in cell culture resulted in increased GLUC secretion in the growth medium when cells were treated with the chemotherapeutic drugs doxorubicin, paclitaxel, and carboplatin. We thus successfully engineered a new variant GLUC protein that is retained inside cells rather than secreted extracellularly. We validated this novel reporter by incorporating it in biosensors for detection of cellular endoplasmic reticulum stress and caspase activation. This new molecularly engineered enzymatic reporter has the potential for widespread applications in biological research.