活性部位のグルタミン酸がアスパラギン酸に変化した変異トリオリオリン酸イソメラーゼの反応エネルギー論

解糖酵素トリオリン酸イソメラーゼの活性部位にある必須触媒塩基は、Glu-165のカルボキシレート基であり、ジヒドロキシアセトンリン酸ジヒドロキシアセトンの1-pro-Rプロトンまたは（R）-glyceraldehyde 3-の2プロトンのいずれかを直接抽象化します。リン酸塩は、シスエンディオール中間体を生成します。サイト指向の突然変異誘発の方法を使用して、Glu-165をASPに置き換えました。チキンマッスルからの3つの酵素チキンイソメラーゼ、大腸菌で発現した野生型鶏イソメラーゼ、および大腸菌で発現した変異体（GLU-165からASPからASP）鶏イソメラーゼはそれぞれ均質に精製されています。2つの野生型イソメラーゼの特異的触媒活性は同一ですが、変異酵素の特定の活性は約1000の係数によって減少します。酵素は、D2O溶媒同位体効果とブロモヒドロキシアセトンリン酸による不活性化の化学量論が野生型および変異体酵素について同一であるため、介在する水分子を介して一般的な基底として機能します。野生型鶏酵素の自由エネルギープロファイルを描写するために使用された同位体実験の範囲を使用して、ここで変異タンパク質によって触媒される反応の完全なエネルギーを導き出します。野生型および変異体イソメーゼの反応エネルギー論の比較は、2つのエノール化ステップの遷移状態の自由エネルギーのみが深刻な影響を受けていることを示しています。プロトン抽象化の各ステップは、変異酵素では約1000倍遅いです。明らかに、必須グルタミン酸の側鎖からのメチレン基の切除は、中間状態の自由エネルギーにほとんど影響を与えませんが、触媒反応の化学的ステップの遷移状態の安定性を劇的に減らします。

The essential catalytic base at the active site of the glycolytic enzyme triosephosphate isomerase is the carboxylate group of Glu-165, which directly abstracts either the 1-pro-R proton of dihydroxyacetone phosphate or the 2-proton of (R)-glyceraldehyde 3-phosphate to yield the cis-enediol intermediate. Using the methods of site-directed mutagenesis, we have replaced Glu-165 by Asp. The three enzymes chicken isomerase from chicken muscle, wild-type chicken isomerase expressed in Escherichia coli, and mutant (Glu-165 to Asp) chicken isomerase expressed in E. coli have each been purified to homogeneity. The specific catalytic activities of the two wild-type isomerases are identical, while the specific activity of the mutant enzyme is reduced by a factor of about 1000. The observed kinetic differences do not derive from a change in mechanism in which the aspartate of the mutant enzyme acts as a general base through an intervening water molecule, because the D2O solvent isotope effects and the stoichiometries of inactivation with bromohydroxyacetone phosphate are identical for the wild-type and mutant enzymes. Using the range of isotopic experiments that were used to delineate the free-energy profile of the wild-type chicken enzyme, we here derive the complete energetics of the reaction catalyzed by the mutant protein. Comparison of the reaction energetics for the wild-type and mutant isomerases shows that only the free energies of the transition states for the two enolization steps have been seriously affected. Each of the proton abstraction steps is about 1000-fold slower in the mutant enzyme. Evidently, the excision of a methylene group from the side chain of the essential glutamate has little effect on the free energies of the intermediate states but dramatically reduces the stabilities of the transition states for the chemical steps in the catalyzed reaction.