QCM-D/MALDI-TOF/MSを介した細菌コンディショニングフィルムからの表面付着タンパク質の識別を促進する新しいデータ処理ルーチン

コンディショニングフィルムは、微生物バイオフィルムの開始と発達における重要な要因であり、医療機器に関連する慢性感染症の主な原因です。ここでは、ヒト病原体緑膿菌PAO1の培養物の上清にさらされた後に形成されたコンディショニングフィルムのタンパク質含有量を分析しました。上清からの物質の接着は、一般的に使用されるインプラント材料二酸化チタン（TIO2）で修飾された散逸モニタリング（QCM-D）センサーチップを使用した石英結晶微量バランスを使用して監視されました。付着タンパク質は、マトリックス支援レーザー脱着/イオン化（MALDI）時間時間（TOF）質量分析（MS）を使用して、オンチップ消化後に同定され、すべてのPAO1タンパク質とPHPスクリプトの理論的トリプティックペプチドを備えたXML-Databaseからなる新しいデータ処理ツール。すべての複製で見つかったタンパク質のみを含むサブデータベースが作成され、MS/MS前駆体の選択に使用されました。次に、得られたMS/MSピークリストは、予想されるペプチド配列の理論的断片化と一致して、タンパク質の同定を検証しました。このアプローチを使用して、40の表面関連タンパク質を特定することができました。アドヘシンなどの細胞外タンパク質に加えて、多くの細胞内タンパク質が同定され、膜形成の条件付けに関与する可能性があり、おそらく細胞溶解後のこれらのタンパク質のまだ身元不明の役割を示唆しています。メソッドのグラフィカルな抽象フローチャート。

Conditioning films are an important factor in the initiation and development of microbial biofilms, which are the leading cause of chronic infections associated with medical devices. Here, we analyzed the protein content of conditioning films formed after exposure to supernatants of cultures of the human pathogen Pseudomonas aeruginosa PAO1. Adhesion of substances from the supernatant was monitored using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) sensor chips modified with the commonly used implant material titanium dioxide (TiO2). Attached proteins were identified after on-chip digestion using matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) time of flight (ToF) mass spectrometry (MS), and a new data processing tool consisting of an XML-database with theoretical tryptic peptides of every PAO1 protein and PHP scripts. Sub-databases containing only proteins, that we found in all replicates, were created and used for MS/MS precursor selection. The obtained MS/MS peaklists were then matched against theoretical fragmentations of the expected peptide sequences to verify protein identification. Using this approach we were able to identify 40 surface-associated proteins. In addition to extracellular proteins such as adhesins, a number of intra-cellular proteins were identified which may be involved in conditioning film formation, suggesting an as-yet unidentified role for these proteins, possibly after cell lysis. Graphical Abstract Flowchart of the method.