HPLC共役タンデム質量分析によるウイルス感染ヒト単球由来細胞のCGAMP定量化

ウイルス感染時に、樹状細胞やマクロファージなどの自然免疫系の細胞は、ウイルス播種を制限するI型インターフェロン（IFN-I）応答をマウントすることができます。宿主細胞にウイルス感染を通知するために、サイトゾルDNAの検出は重要なメカニズムの1つです。内因性DNAの不適切なセンシングとその後のIFN-I応答の誘導も自己免疫を引き起こす可能性があり、DNAセンシングをしっかりと調節する必要性を強調します。環状GMP-AMPシンターゼ（CGAS）は、最近、IFN-I発現を引き起こすサイトゾルDNAの主要なセンサーであることが確認されました。DNA結合により、CGASは、インターフェロン遺伝子の刺激因子（STING）の活性化によりIFN-I発現を誘導する第2メッセンジャーサイクリックグアノシン - アデノシン単リン酸（CGAMP）を合成します。特に、CGAMPは感染した細胞に作用するだけでなく、IFN-I発現をトリガーするために、感染していないバイスタンダー細胞に移動することもできます。したがって、自然免疫系の細胞におけるCGAMPの直接的な定量化は、DNAがどこで、いつ、どのように感知され、IFN-I応答が誘導されるかを研究するための重要なアプローチです。ここでは、HPLC共役タンデム質量分析によるウイルス感染ヒト骨髄細胞の抽出物からのCGAMPの特定の定量化を可能にする方法について説明します。

Upon virus infection, cells of the innate immune system such as dendritic cells and macrophages can mount type I interferon (IFN-I) responses that restrict viral dissemination. To inform host cells of virus infection, detection of cytosolic DNA is one important mechanism. Inappropriate sensing of endogenous DNA and subsequent induction of IFN-I responses can also cause autoimmunity, highlighting the need to tightly regulate DNA sensing. The cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) was recently identified to be the major sensor of cytosolic DNA that triggers IFN-I expression. Upon DNA binding, cGAS synthesizes the second messenger cyclic guanosine-adenosine monophosphate (cGAMP) that induces IFN-I expression by the activation of the stimulator of interferon genes (STING). Notably, cGAMP does not only act in infected cells, but can also be relocated to noninfected bystander cells to there trigger IFN-I expression. Thus, direct quantification of cGAMP in cells of the innate immune system is an important approach to study where, when, and how DNA is sensed and IFN-I responses are induced. Here, we describe a method that allows specific quantification of cGAMP from extracts of virus-infected human myeloid cells by HPLC-coupled tandem mass spectrometry.