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薬物感受性に直接関連する細菌遺伝子の単一のヌクレオチド点突然変異の迅速かつ容易な検出は、抗菌剤の適切な使用に不可欠です。ここでは、マクロライド（ML）に受け入れられるマイコプラズマ肺炎のペプチド核酸媒介ループ媒介増幅（LAMP）アッセイを使用した検出方法を確立しました。このアッセイは、23S rRNAをコードする遺伝子のドメインVの中心ループをコードするミスセンス変異の欠如を特異的に検出し、MLSの親和性を低下させ、その後M. pneumoniaeのML耐性株を生成することができます。反応は62°Cで60分間行われ、ターゲットされた遺伝子増幅は、タービジメーターと色の変化の裸の目検査によるリアルタイム濁度によって検出されました。アッセイの同等の検出限界は、タービジメーターを使用したDNA 100.0fgのDNAであり、54種類の病原体に対する特異性を示しましたが、2063Aおよび2064Aでの点変異の存在下で、反応ごとに100.0pgのDNAでさえ、増幅が完全にブロックされました。予想されるランプ製品は、リアルタイムランプ手順で同一の溶融曲線によって確認されました。この方法は、ML耐性肺炎株における点変異2063Aおよび2064Aを運ぶ配列を増幅することなく、ポイントオブケアテスト技術としての単一ヌクレオチド多型ジェノタイピングの単一ヌクレオチド多型ジェノタイピングの単純かつ迅速なプロトコルになります。
薬物感受性に直接関連する細菌遺伝子の単一のヌクレオチド点突然変異の迅速かつ容易な検出は、抗菌剤の適切な使用に不可欠です。ここでは、マクロライド（ML）に受け入れられるマイコプラズマ肺炎のペプチド核酸媒介ループ媒介増幅（LAMP）アッセイを使用した検出方法を確立しました。このアッセイは、23S rRNAをコードする遺伝子のドメインVの中心ループをコードするミスセンス変異の欠如を特異的に検出し、MLSの親和性を低下させ、その後M. pneumoniaeのML耐性株を生成することができます。反応は62°Cで60分間行われ、ターゲットされた遺伝子増幅は、タービジメーターと色の変化の裸の目検査によるリアルタイム濁度によって検出されました。アッセイの同等の検出限界は、タービジメーターを使用したDNA 100.0fgのDNAであり、54種類の病原体に対する特異性を示しましたが、2063Aおよび2064Aでの点変異の存在下で、反応ごとに100.0pgのDNAでさえ、増幅が完全にブロックされました。予想されるランプ製品は、リアルタイムランプ手順で同一の溶融曲線によって確認されました。この方法は、ML耐性肺炎株における点変異2063Aおよび2064Aを運ぶ配列を増幅することなく、ポイントオブケアテスト技術としての単一ヌクレオチド多型ジェノタイピングの単一ヌクレオチド多型ジェノタイピングの単純かつ迅速なプロトコルになります。
Rapid and easy detection of a single nucleotide point mutation of bacterial genes, which is directly linked to drug susceptibility, is essential for the proper use of antimicrobial agents. Here, we established a detection method using a peptide nucleic acid mediated loop-mediated amplification (LAMP) assay for macrolide (ML)-susceptible Mycoplasma pneumoniae. This assay specifically detected the absence of missense mutations encoding the central loop of domain V in the gene encoding 23S rRNA, which can reduce the affinity for MLs and subsequently generate ML-resistant strains of M. pneumoniae. Reactions were performed at 62°C for 60min and targeted gene amplifications were detected by real-time turbidity with a turbidimeter and naked-eye inspection of a color change. The assay had an equivalent detection limit of 100.0fg of DNA with the turbidimeter and showed specificity against 54 types of pathogens, whereas amplification was completely blocked, even at 100.0pg of DNA per reaction, in the presence of point mutations at 2063A and 2064A. The expected LAMP products were confirmed through identical melting curves in real-time LAMP procedures. This method would be a simple and rapid protocol for single nucleotide polymorphism genotyping as point-of-care testing technology without amplification of the sequences carrying the point mutations 2063A and 2064A in ML-resistant M. pneumoniae strains.
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