モノクローナル抗体ベースのFACSウイルスエンベロープタンパク質の選択のための哺乳類細胞表面表示

活性免疫によるヒトの広範かつ効率的に中和抗体の誘発は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、インフルエンザウイルス、インフルエンザC型肝炎ウイルス、またはサイトメガロウイルスなどの病原体に対するワクチンの発生における依然として大きな障害です。ここでは、ライブラリからのエンベロープ（env）バリアントのアフィニティベースの選択を可能にする哺乳類の細胞表面ディスプレイとモノクローナル抗体（MAB）を介したパンニング技術について説明します。この目的のために、1）遺伝子型と表現型をリンクするためのENVの単一および部位固有の統合、2）細胞毒性効果を回避するための誘導性ENV発現、3）ENVの翻訳結合と緑化した緑色蛍光タンパク質発現の強化を正常化するENVタンパク質レベルの場合、および4）HEK細胞に表示して、天然の折りたたみと哺乳類のグリコシル化を確保します。概念実証のために、V3ループ指向のMABS 447-52DおよびHGN194に微分結合親和性を持つバリアントを含むキメラHIV-1 ENVモデルライブラリに方法を適用しました。蛍光活性化細胞選別は、1ラウンドのパンニングの後、それぞれ447-52DおよびHGN194で最大56および55倍までの高い親和性変異体を選択的に濃縮しました。同様に、各抗体の低い親和性変異体は、最大237倍まで選択的に濃縮される可能性があります。膜結合GP145および可溶性GP140キメラの結合プロファイルは同一の親和性ランキングを示し、この技術はワクチン候補としてその後使用するために最適化された抗原特性を持つENVバリアントの同定を導くことができることを示唆しています。最後に、MABベースの細胞表示と選択戦略は、HIV以外の病原体に対する予防ワクチンの開発にも役立つ可能性があります。

The elicitation of broadly and efficiently neutralizing antibodies in humans by active immunization is still a major obstacle in the development of vaccines against pathogens such as the human immunodeficiency virus (HIV), influenza virus, hepatitis C virus or cytomegalovirus. Here, we describe a mammalian cell surface display and monoclonal antibody (mAb)-mediated panning technology that allows affinity-based selection of envelope (Env) variants from libraries. To this end, we established an experimental setup featuring: 1) single and site specific integration of Env to link genotype and phenotype, 2) inducible Env expression to avoid cytotoxicity effects, 3) translational coupling of Env and enhanced green fluorescent protein expression to normalize for Env protein levels, and 4) display on HEK cells to ensure native folding and mammalian glycosylation. For proof of concept, we applied our method to a chimeric HIV-1 Env model library comprising variants with differential binding affinities to the V3-loop-directed mAbs 447-52D and HGN194. Fluorescence-activated cell sorting selectively enriched a high affinity variant up to 56- and 55-fold for 447-52D and HGN194, respectively, after only a single round of panning. Similarly, the low affinity variants for each antibody could be selectively enriched up to 237-fold. The binding profiles of membrane-bound gp145 and soluble gp140 chimeras showed identical affinity ranking, suggesting that the technology can guide the identification of Env variants with optimized antigenic properties for subsequent use as vaccine candidates. Finally, our mAb-based cellular display and selection strategy may also prove useful for the development of prophylactic vaccines against pathogens other than HIV.