多孔性グラファイト炭素ベースの液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析を使用した低レベルのアデニンヌクレオチドの分離と定量化のための敏感な方法

加熱エレクトロスプレーイオン化/タンデム質量分析（LC-HESI-MS/MS）と結合した液体クロマトグラフィーは、低ナノモルレベルのアデニンヌクレオチドAMP、ADP、ATP、環状AMP（cAMP）、およびヌクレオシドイジドイジドイジドジドイジドイジド化の同時定量分析のために開発されました。アデノシン。分析物の保持と分離のために、多孔質グラファイト炭素（PGC）を使用した逆位相クロマトグラフィーが完全に解像度を提供したときに採用されました。分析物の解像度の劣化とピーク尾部の増加（感度の低下につながる）を含むPGCの特徴的な不規則なクロマトグラフィーの挙動は、第四紀勾配を使用して実行内に酸性平衡化を組み込むことにより緩和されました。分析物の解像度とクロマトグラフィー感度は、カラムの不活性の期間後も依然として失われました。したがって、列を再生するために、バッチ間に事前調整プロトコルが実装されました。これらのカラム再生測定により、モノヌクレオチドのシーケンスでAMP、ADP、およびATPの溶出が可能になりました。このヌクレオチド溶出シーケンスには、ATPのソース内断片化によって引き起こされる小さなヌクレオチドの潜在的な誤発音と不正確な定量化を克服するという利点があります。この方法は、ほとんどの分析対象物でLLOQが10〜50nmの範囲で、顆粒膜細胞条件付き培地で検証されました。生物学的サンプルを使用して方法を検証するために、ヌクレオチド分泌は、レベルを変えることが知られているさまざまな処理の下で顆粒膜細胞条件付き培地で測定されました。さらに、この方法は、複雑なマトリックス内のその直線性を調べるために、積孔球菌複合体細胞溶解物に適用されました。

A liquid chromatography coupled to heated electrospray ionization/tandem mass spectrometry (LC-HESI-MS/MS) method was developed for the simultaneous quantitative analysis of low nanomolar level adenine nucleotides AMP, ADP, ATP, cyclic AMP (cAMP), and the nucleoside adenosine. For analyte retention and separation, reverse phase chromatography using porous graphitic carbon (PGC) was employed as it provided full resolution. The erratic chromatographic behaviour characteristic of PGC, including deterioration of analyte resolution and increased peak tailing (leading to decreased sensitivity), was mitigated by incorporating acidic equilibration within runs using a quaternary gradient. Analyte resolution and chromatographic sensitivity were still lost after a period of column inactivity; hence a pre-conditioning protocol was implemented between batches to regenerate the column. These column regeneration measures also allowed elution of AMP, ADP and ATP in the sequence of mono- to tri- nucleotides, differing from conventional reverse phase elution where analytes elute with decreasing polarity. This nucleotide elution sequence has the advantage of overcoming potential mis-annotation and inaccurate quantification of smaller nucleotides caused by in-source fragmentation of ATP. The method was validated in granulosa cell conditioned media, with the LLOQs ranging between 10-50nM for most analytes. To verify the method using biological samples, nucleotide secretion was measured in granulosa cell conditioned media under various treatments known to alter their levels. Moreover, the method was applied to cumulus-oocyte complex cell lysates to examine its linearity in a complex matrix.