新規プロテインCファクターVIIキメラは、細胞保護プロテアーゼ活性化受容体1シグナル伝達の構造要件に関する新しい洞察を提供します

非標識：エッセンシャル細胞保護プロテアーゼ活性化受容体1（PAR1）シグナル伝達の基礎は完全には理解されていません。活性化されたプロテインCキメラ（APCFVII-82）を使用して、PAR1シグナル伝達の要件を特定しました。APCFVII-82はPAR1シグナル伝達を開始しませんでしたが、単球抗炎症活性を付与しました。APC特異的な軽鎖残基は、細胞保護PAR1シグナル伝達に必要です。 概要：バックグラウンド活性化タンパク質C（APC）細胞シグナル伝達は、内皮細胞（EC）タンパク質C（PC）受容体（EPCR）に結合した場合、プロテアーゼ活性化受容体（PAR）1タンパク質分解を媒介する能力に大きく依存しています。さらに、EPCR結合PCは、トロンビンによるPAR1シグナル伝達を調節して、APC様EC細胞保護を誘導します。目的EPCR依存性細胞保護PAR1シグナル伝達の分子決定因子は、不十分に定義されたままです。これに対処するために、FVII N末端ドメインと保存されたEPCR結合を所有するPCファクターVIIキメラ（PCFVII-82）が特徴付けられました。メソッド活性化されたPC-FVIIキメラ（APCFVII-82）抗凝固活性は、キャリブレーションされた自動血栓造影および活性化されたFV分解アッセイで測定されました。APCFVII-82シグナル伝達活性は、PAR1タンパク質分解とECバリアの完全性のレポーターアッセイの使用によって特徴付けられました。APCFVII-82抗炎症活性は、単球からの核因子κB（NF-κB）の活性化とサイトカイン分泌の阻害に従って評価されました。結果PCFVII-82は通常、ECS上のトロンビンによって活性化されましたが、血漿トロンビン生成を阻害することはできませんでした。驚くべきことに、APCFVII-82はEPCR依存性PAR1タンパク質分解を媒介せず、トロンビン誘発ECバリアの破壊のPAR1依存性保護を付与するか、リポジル糖（LPS）刺激されたマクロップ段階からのインターロイキン6放出のPAR1依存性減衰を制限しました。興味深いことに、アクティブサイトブロックされたAPCFVII-82によるEPCR占有は、FVIIと同様に、トロンビンによるPAR1タンパク質分解時にPCによって誘発されるECバリア安定化を模倣することができませんでした。しかし、APCFVII-82は、野生型APCと同様の有効性を持つ、アポリポタンパク質E受容体2依存的な方法で、単球からのLPS誘発NF-κB活性化および腫瘍壊死因子-α放出を減少させました。結論これらの発見は、細胞保護Par1シグナル伝達を可能にする際に、EPCR結合部位の外側のAPC軽鎖アミノ酸残基の新しい役割を特定します。

UNLABELLED: Essentials The basis of cytoprotective protease-activated receptor 1 (PAR1) signaling is not fully understood. Activated protein C chimera (APCFVII-82 ) was used to identify requirements for PAR1 signaling. APCFVII-82 did not initiate PAR1 signaling, but conferred monocyte anti-inflammatory activity. APC-specific light chain residues are required for cytoprotective PAR1 signaling. SUMMARY: Background Activated protein C (APC) cell signaling is largely reliant upon its ability to mediate protease-activated receptor (PAR) 1 proteolysis when bound to the endothelial cell (EC) protein C (PC) receptor (EPCR). Furthermore, EPCR-bound PC modulates PAR1 signaling by thrombin to induce APC-like EC cytoprotection. Objective The molecular determinants of EPCR-dependent cytoprotective PAR1 signaling remain poorly defined. To address this, a PC-factor VII chimera (PCFVII-82 ) possessing FVII N-terminal domains and conserved EPCR binding was characterized. Methods Activated PC-FVII chimera (APCFVII-82 ) anticoagulant activity was measured with calibrated automated thrombography and activated FV degradation assays. APCFVII-82 signaling activity was characterized by the use of reporter assays of PAR1 proteolysis and EC barrier integrity. APCFVII-82 anti-inflammatory activity was assessed according to its inhibition of nuclear factor-κB (NF-κB) activation and cytokine secretion from monocytes. Results PCFVII-82 was activated normally by thrombin on ECs, but was unable to inhibit plasma thrombin generation. Surprisingly, APCFVII-82 did not mediate EPCR-dependent PAR1 proteolysis, confer PAR1-dependent protection of thrombin-induced EC barrier disruption, or limit PAR1-dependent attenuation of interleukin-6 release from lipopolysaccharide (LPS)-stimulated macrophages. Interestingly, EPCR occupation by active site-blocked APCFVII-82 was, like FVII, unable to mimic EC barrier stabilization induced by PC upon PAR1 proteolysis by thrombin. APCFVII-82 did, however, diminish LPS-induced NF-κB activation and tumor necrosis factor-α release from monocytes in an apolipoprotein E receptor 2-dependent manner, with similar efficacy as wild-type APC. Conclusions These findings identify a novel role for APC light chain amino acid residues outside the EPCR-binding site in enabling cytoprotective PAR1 signaling.