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甲状腺ホルモン（TH）のチロシンおよびフェノールリング脱異数酸化は、生理学的活性を調節するために重要です。さらに、チロノミン（TAM）へのカルボキシル化や甲状酢酸（TAC）への脱アミノ化などの反応は、異なる生物学的特性を持つ代謝産物（THM）を生成します。これは、THとTHMの効果を研究するときに考慮する必要があります。細胞培養上清および細胞溶解物におけるTHおよびTHMの正確かつ正確な定量分析は、THのin vitro代謝を研究するために必要な重要な手順です。ここでは、ヒト肝細胞癌HEP G2細胞溶解物抽出物における9チロニン（TN）および6 TAMの定量化のための液液抽出/同位体溶解クロマトグラフィー - 液体クロマトグラフィーエレクトロスプレータンデム質量分析（LC-MS/MS）法の開発を報告します。さらに、FBSが枯渇したラット甲状腺上皮PCCL3細胞の細胞溶解物におけるTH、TAM、およびTACを定量化する方法を適応させました。両方の細胞株の方法は、線形性、定量化と検出の制限（それぞれLLOQおよびLLOD）、日中および日間精度、精度、プロセス効率（PE）、マトリックス効果（ME）、相対回復（RE）の厳密な評価によって検証されました。HEP G2およびPCCL3細胞では、11の濃度（400μLの溶解物に基づく）をカバーするキャリブレーション曲線（400μLの溶解物に基づく）は、それぞれ0.016-50 nmおよび0.010-50 nmで線形でした。定量化の下限は、0.031〜1 nmの範囲でした。LC-MS/MSメソッドのPCCL3バージョンを、3-ヨード-L-チロニン（T1）、3-ヨードチロノミン（3-T1AM）および3-ヨウソリオアセティック酸（3-T1AC）とインキュベートしたPCCL3細胞からの溶解細胞抽出物の分析に適用しました。30分間のインキュベーション3-t1amを4- [4-（2-アミノエチルフェノキシ）]フェノール（チロノミン、T0AM）にそれぞれ4- [4-（2-アミノエチルフェノキシ）に脱ヨウ素化し、3-T1ACに脱アミノートしたが、T1はT0への脱オジョンを受けた。このデータは、これらのモノヨウ素化化合物の熱心な代謝と、そのような細胞代謝を定量化するためのLC-MS/MSの有用性を示しています。
甲状腺ホルモン（TH）のチロシンおよびフェノールリング脱異数酸化は、生理学的活性を調節するために重要です。さらに、チロノミン（TAM）へのカルボキシル化や甲状酢酸（TAC）への脱アミノ化などの反応は、異なる生物学的特性を持つ代謝産物（THM）を生成します。これは、THとTHMの効果を研究するときに考慮する必要があります。細胞培養上清および細胞溶解物におけるTHおよびTHMの正確かつ正確な定量分析は、THのin vitro代謝を研究するために必要な重要な手順です。ここでは、ヒト肝細胞癌HEP G2細胞溶解物抽出物における9チロニン（TN）および6 TAMの定量化のための液液抽出/同位体溶解クロマトグラフィー - 液体クロマトグラフィーエレクトロスプレータンデム質量分析（LC-MS/MS）法の開発を報告します。さらに、FBSが枯渇したラット甲状腺上皮PCCL3細胞の細胞溶解物におけるTH、TAM、およびTACを定量化する方法を適応させました。両方の細胞株の方法は、線形性、定量化と検出の制限（それぞれLLOQおよびLLOD）、日中および日間精度、精度、プロセス効率（PE）、マトリックス効果（ME）、相対回復（RE）の厳密な評価によって検証されました。HEP G2およびPCCL3細胞では、11の濃度（400μLの溶解物に基づく）をカバーするキャリブレーション曲線（400μLの溶解物に基づく）は、それぞれ0.016-50 nmおよび0.010-50 nmで線形でした。定量化の下限は、0.031〜1 nmの範囲でした。LC-MS/MSメソッドのPCCL3バージョンを、3-ヨード-L-チロニン（T1）、3-ヨードチロノミン（3-T1AM）および3-ヨウソリオアセティック酸（3-T1AC）とインキュベートしたPCCL3細胞からの溶解細胞抽出物の分析に適用しました。30分間のインキュベーション3-t1amを4- [4-（2-アミノエチルフェノキシ）]フェノール（チロノミン、T0AM）にそれぞれ4- [4-（2-アミノエチルフェノキシ）に脱ヨウ素化し、3-T1ACに脱アミノートしたが、T1はT0への脱オジョンを受けた。このデータは、これらのモノヨウ素化化合物の熱心な代謝と、そのような細胞代謝を定量化するためのLC-MS/MSの有用性を示しています。
Tyrosine and phenolic ring de-iodination of thyroid hormones (TH) is crucial for regulating their physiological activity. Furthermore, reactions such as de-carboxylation to thyronamines (TAM) and de-amination to thyroacetic acids (TAc) produce TH metabolites (THM) with distinct biological properties. This needs to be considered when studying effects of TH and THM. The accurate and precise quantitative analysis of TH and THM in cell culture supernatants and cell lysates are key procedures required for studying the in vitro metabolism of TH. We report here the development of a liquid-liquid extraction/isotope dilution-liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method for the quantification of 9 thyronines (TN) and 6 TAM in human hepatocellular carcinoma Hep G2 cell lysate extracts. In addition, we adapted the method to quantify TH, TAM and TAc, in cell lysates of FBS-depleted rat thyroid epithelium PCCL3 cells. The methods for both cell lines were validated by rigorous assessment of linearity, limits of quantification and detection (LLOQ and LLOD respectively), intra- and inter-day accuracy, precision, process efficiency (PE), matrix effect (ME) and relative recovery (RE). Calibration curves covering 11 concentrations (based on 400 μl of lysate) were linear in the range 0.016-50 nM and 0.010-50 nM for Hep G2 and PCCL3 cells respectively. The lower limits of quantification were in the range 0.031 to 1 nM. We applied the PCCL3 version of the LC-MS/MS method to the analysis of lysed cell extracts from PCCL3 cells that had been incubated with 3-iodo-L-thyronine (T1), 3-iodothyronamine (3-T1AM) and 3-iodothyroacetic acid (3-T1Ac). Over the course of 30 minutes incubation 3-T1AM was de-iodinated to 4-[4-(2-aminoethylphenoxy)]phenol (thyronamine, T0AM) and de-aminated to 3-T1Ac respectively, whilst T1 underwent de-iodination to T0. This data indicates avid metabolism of these mono-iodinated compounds and the utility of LC-MS/MS to quantify such cellular metabolism.
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