ジシアノヘミンの取り込みを介した活性アポヘモグロビンヘム結合部位の定量化

アポヘモグロビン（ApoHB）は、ヘモグロビン（HB）からヘムを除去することにより生成されます。ただし、ApoHBの準備には損傷したグロビンが含まれている可能性があり、総タンパク質アッセイがアクティブなAPOHB定量のために不正確になります。幸いなことに、ApoHBヘム結合部位は、近位ヒスチジンF8（His-F8）残基を介してヘムと反応し、分光光度化的に監視できます。ApoHBのHis-F8残基とヘムの間の結合は、完全に機能的で協調的なHBの維持に不可欠です。さらに、ほとんどのAPOHB薬物送達アプリケーションは、His-F8残基が存在するApoHB疎水性ヘム結合ポケット内での疎水性薬物取り込みを促進します。これにより、His-F8残基はAPOHB活性の定量化の適切な標的になります。この研究では、安定したモノマーポルフィリン種であるジシアノヘミン（DCNH）が、モノサイアノヘミンHIS-F8結合形成を介して活性アポフを定量化するプローブ分子として使用されました。APOHB活性は、DCNHおよびAPOHB混合物の420 nM平衡吸光度の分析を介して定量化されました。彼のF8飽和は、DCNH濃度の増加に対する固定濃度のApoHBの420 nm吸光度のプロットからの変曲点の存在によって決定されました。アッセイの精度を実証するために、さまざまな濃度のストックAPOHB溶液をテストしました。アッセイの精度は、スペクトルデコンボリューションを介して評価され、屈折点での彼のF8飽和を確認しました。ヘム結合タンパク質ウシ血清アルブミンとアッセイの感受性に対する沈殿したアポフの効果は有意ではありませんでした。再構成されたHBの生物物理学的特性の分析により、ヘム結合ポケット活動が確認されました。まとめると、このアッセイは、ApoHB活性を決定するためのシンプルで信頼できる方法を提供します。

Apohemoglobin (apoHb) is produced by removing heme from hemoglobin (Hb). However, preparations of apoHb may contain damaged globins, which render total protein assays inaccurate for active apoHb quantification. Fortunately, apoHb heme-binding sites react with heme via the proximal histidine-F8 (His-F8) residue, which can be monitored spectrophotometrically. The bond between the His-F8 residue of apoHb and heme is vital for maintenance of fully functional and cooperative Hb. Additionally, most apoHb drug delivery applications facilitate hydrophobic drug incorporation inside the apoHb hydrophobic heme-binding pocket in which the His-F8 residue resides. This makes the His-F8 residue a proper target for apoHb activity quantification. In this work, dicyanohemin (DCNh), a stable monomeric porphyrin species, was used as a probe molecule to quantify active apoHb through monocyanohemin-His-F8 bond formation. ApoHb activity was quantified via the analysis of the 420 nm equilibrium absorbance of DCNh and apoHb mixtures. His-F8 saturation was determined by the presence of an inflection point from a plot of the 420 nm absorbance of a fixed concentration of apoHb against an increasing DCNh concentration. Various concentrations of a stock apoHb solution were tested to demonstrate the precision of the assay. The accuracy of the assay was assessed via spectral deconvolution, confirming His-F8 saturation at the inflection point. The effect of the heme-binding protein bovine serum albumin and precipitated apoHb on assay sensitivity was not significant. An analysis of the biophysical properties of reconstituted Hb confirmed heme-binding pocket activity. Taken together, this assay provides a simple and reliable method for determination of apoHb activity.