ヒト血液血漿細胞のないDNAの大部分がエキソソームに局在するという新しい証拠

血液中の細胞を含まないDNA（CfDNA）は、臨床診療における非侵襲的出生前および癌診断アッセイの遺伝物質の源として使用されます。最近、新しい非侵襲的診断アッセイを開発するために、新しいバイオマーカー発見のプロジェクトを開始しました。文献をレビューしている間、エキソソームは人間の健康と病気に重要な役割を果たすため、エキソソームはバイオマーカーの豊富な源である可能性があることがわかりました。ヒトの血漿に見られるエキソソームを特徴付ける一方で、血漿エキソソームにCfDNAの存在が観察されました。血漿は、K3EDTAチューブに引き込まれた血液から得られました。エキソソームは、市販のキットを使用して、細胞のない血漿から分離されました。エキソソームのサイジングと列挙は、電子顕微鏡とナノサイト粒子カウンターを使用して行われました。Nanosightおよび共焦点顕微鏡を使用して、DSDNAとエキソソームの関連性を実証しました。血漿およびエキソソームから抽出されたDNAは、蛍光法と液滴デジタルPCR（DDPCR）メソッドによって測定されました。血漿から分離された細胞外小胞のサイズは不均一であり、平均値は92.6 nm、モード39.7 nmを示しました。血漿から分離された細胞外小胞の大部分は、エキソソームと3つのタンパク質マーカー、Hsp70、CD9、およびCD63に特異的な蛍光プローブを使用してエキソソームとして同定されました。染色dsDNAを染色する蛍光染料は、エキソソームとdsDNAの間の関連を示しました。血漿CFDNA濃度分析では、血漿中の増幅可能なCfDNAの93％以上が血漿エキソソームに位置していることが示されました。血液サンプルの貯蔵は、エキソソーム数とエキソソームDNA濃度の有意な増加を示しました。この研究は、血漿CfDNAの大部分がエキソソームに局在しているという証拠を提供します。細胞からのエキソソーム放出は代謝エネルギー依存プロセスであり、したがって、血漿中のCfDNAの源として細胞からのCfDNAの活性放出を示唆しています。

Cell-free DNA (cfDNA) in blood is used as a source of genetic material for noninvasive prenatal and cancer diagnostic assays in clinical practice. Recently we have started a project for new biomarker discovery with a view to developing new noninvasive diagnostic assays. While reviewing literature, it was found that exosomes may be a rich source of biomarkers, because exosomes play an important role in human health and disease. While characterizing exosomes found in human blood plasma, we observed the presence of cfDNA in plasma exosomes. Plasma was obtained from blood drawn into K3EDTA tubes. Exosomes were isolated from cell-free plasma using a commercially available kit. Sizing and enumeration of exosomes were done using electron microscopy and NanoSight particle counter. NanoSight and confocal microscopy was used to demonstrate the association between dsDNA and exosomes. DNA extracted from plasma and exosomes was measured by a fluorometric method and a droplet digital PCR (ddPCR) method. Size of extracellular vesicles isolated from plasma was heterogeneous and showed a mean value of 92.6 nm and a mode 39.7 nm. A large proportion of extracellular vesicles isolated from plasma were identified as exosomes using a fluorescence probe specific for exosomes and three protein markers, Hsp70, CD9 and CD63, that are commonly used to identify exosome fraction. Fluorescence dye that stain dsDNA showed the association between exosomes and dsDNA. Plasma cfDNA concentration analysis showed more than 93% of amplifiable cfDNA in plasma is located in plasma exosomes. Storage of a blood sample showed significant increases in exosome count and exosome DNA concentration. This study provide evidence that a large proportion of plasma cfDNA is localized in exosomes. Exosome release from cells is a metabolic energy dependent process, thus suggesting active release of cfDNA from cells as a source of cfDNA in plasma.