蛍光寿命イメージング顕微鏡（FRET/FLIM）を介したフェルスター共鳴エネルギー移動を測定することによる生体内相互作用研究

複数の蛍光融合タンパク質の組み合わせは一般的に生成され、ライブ細胞イメージングの共局在研究に使用されますが、in vitroでの共免疫沈降によるタンパク質間相互作用の生化学的分析も使用されます。蛍光寿命イメージング顕微鏡（FRET/FLIM）を介したFörster共鳴エネルギー移動などの高度な顕微鏡技術が最近、両方のアプローチの組み合わせを可能にしています。これにより、in vivoで位置固有のタンパク質間相互作用分析を実行する可能性が開かれます。この目的のために、ドナーからアクセプターフルオロフォア（FRET）への非放射エネルギー移動は、相互作用の指標として近接性をテストするために活用されていますが、フリムによる蛍光寿命の分光路鏡測定は、ここで説明します。RFPタグ付きGFPナノボディとそのエピトープGFPとの相互作用を実証するために、ライカTCS SP8/PicoHarp 300の組み合わせで実行されたFRET/FLIM測定は、タバコ葉肉プロトプラストの細胞質におけるそのエピトープGFPとの相互作用を実証しました。

Combinations of multiple fluorescent fusion proteins are commonly generated and used for colocalization studies in live cell imaging but also biochemical analysis of protein-protein interactions by co-immunoprecipitation in vitro. Advanced microscopy techniques like Förster resonance energy transfer through fluorescence lifetime imaging microscopy (FRET/FLIM) nowadays enable the combination of both approaches. This opens up the possibility to perform a location-specific protein-protein interaction analysis in vivo. To this end, the nonradiant energy transfer from a donor to an acceptor fluorophore (FRET) is harnessed to test for close proximity as an indicator for interaction, while the spectromicroscopical measurement of the fluorescence lifetime by FLIM serves as a readout.Here, we describe FRET/FLIM measurements performed with a Leica TCS SP8/PicoHarp 300 combination to demonstrate the interaction between a RFP-tagged GFP-nanobody and its epitope, GFP, in the cytoplasm of tobacco mesophyll protoplasts.