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背景：テトラゾリウムベースのアッセイは、マイクロタイタープレートの単層または懸濁細胞の増殖/毒性を評価するために最適化されています。組織工学および再生医療に関して、3Dミクロチーズのようなin vivoの必要性は、より増加する関連性を持っています。テトラゾリウムベースのアッセイを3D培養システムに適用することは、技術的により困難です。構成された微小環境は、アッセイ標準に影響を与える可能性があります。テトラゾリウムの平等な分布。 目的：ヒト軟骨細胞のスフェロイド培養（3D）に関する膜浸透性テトラゾリウム塩ベースのアッセイの評価。 方法：軟骨細胞は、ヒトの関節軟骨から分離されました。XTT、WST-1、およびWST-8は、96wellプレートの単層細胞（2D、変化する細胞数）およびスフェロイド（3D、異なるサイズ）に適用されました。ホルマザン形成は、異なるインキュベーション期間後に分光測光で測定されました。評価は、相コントラストマイクロソピー（毒性）を使用して行われ、細胞数と吸光度シグナル（Gompertz関数）の相関を分析し、バックグラウンド比の文書信号を分析しました。 結果：単層培養では、アッセイは、播種された細胞数と吸収データとの相関関係を示しました。スフェロイドサイズは、開始セル数に直接関連しています。サイズと吸光度の間の相関は、10,000セル/凝集体からのみ検出可能でした。単層細胞の位相造影顕微鏡検査により、WST-1（4時間）およびXTT（8時間）アッセイの強い毒性効果が明らかになり、WST-8を使用した毒性の兆候はありませんでした。 結論：WST-8アッセイは非毒性であり、XTTまたはWST-1アッセイと比較して最高の感度を明らかにしました。スフェロイドの外側の細胞のみが膜浸透性テトラゾリウム塩をホルマザンに変換できるという証拠があります。
背景：テトラゾリウムベースのアッセイは、マイクロタイタープレートの単層または懸濁細胞の増殖/毒性を評価するために最適化されています。組織工学および再生医療に関して、3Dミクロチーズのようなin vivoの必要性は、より増加する関連性を持っています。テトラゾリウムベースのアッセイを3D培養システムに適用することは、技術的により困難です。構成された微小環境は、アッセイ標準に影響を与える可能性があります。テトラゾリウムの平等な分布。 目的：ヒト軟骨細胞のスフェロイド培養（3D）に関する膜浸透性テトラゾリウム塩ベースのアッセイの評価。 方法：軟骨細胞は、ヒトの関節軟骨から分離されました。XTT、WST-1、およびWST-8は、96wellプレートの単層細胞（2D、変化する細胞数）およびスフェロイド（3D、異なるサイズ）に適用されました。ホルマザン形成は、異なるインキュベーション期間後に分光測光で測定されました。評価は、相コントラストマイクロソピー（毒性）を使用して行われ、細胞数と吸光度シグナル（Gompertz関数）の相関を分析し、バックグラウンド比の文書信号を分析しました。 結果：単層培養では、アッセイは、播種された細胞数と吸収データとの相関関係を示しました。スフェロイドサイズは、開始セル数に直接関連しています。サイズと吸光度の間の相関は、10,000セル/凝集体からのみ検出可能でした。単層細胞の位相造影顕微鏡検査により、WST-1（4時間）およびXTT（8時間）アッセイの強い毒性効果が明らかになり、WST-8を使用した毒性の兆候はありませんでした。 結論：WST-8アッセイは非毒性であり、XTTまたはWST-1アッセイと比較して最高の感度を明らかにしました。スフェロイドの外側の細胞のみが膜浸透性テトラゾリウム塩をホルマザンに変換できるという証拠があります。
BACKGROUND: Tetrazolium-based assays are optimized to assess proliferation/toxicity of monolayer or suspension cells in microtiter plates. With regard to tissue engineering and regenerative medicine the need for in vivo like 3D microtissues has an increasing relevance. Applying tetrazolium-based assays to 3D culture systems is technically more challenging. The composed microenvironment may influence the assay standards, e.g. equal distribution of tetrazolium. OBJECTIVE: Evaluation of membrane-impermeable tetrazolium salt-based assays with regard to spheroid culture (3D) of human chondrocytes. METHODS: Chondrocytes were isolated from human articular cartilage. XTT, WST-1, and WST-8 were applied to monolayer cells (2D, varying cell numbers) and spheroids (3D, different sizes) in 96well plates. Formazan formation was measured spectrophotometrically after different incubation periods. Evaluation was done using phase contrast microsopy (toxicity), analyzing the correlation of cell number and absorbance signals (Gompertz function), and document signal over background ratio. RESULTS: In monolayer culture the assays showed a correlation between seeded cell numbers and absorption data. Spheroid sizes are directly related to the starting cell number. A correlation between size and absorbance was only detectable starting from 10,000 cells/aggregate. Phase contrast microscopy of monolayer cells revealed strong toxicity effects of the WST-1 (4 h) and XTT (8 h) assay and no signs of toxicity using WST-8. CONCLUSION: The WST-8 assay is non-toxic and revealed the highest sensitivity in comparison to the XTT or WST-1 assay. There is evidence, that only cells of the outer rim of spheroids are able to convert membrane-impermeable tetrazolium salts to formazans.
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