次世代シーケンスを使用したCtDNAのまれな変異の検出

次世代シーケンス（NGS）を使用した循環腫瘍DNA（CTDNA）の分析は、臨床腫瘍学の開発のための貴重なツールになりました。ただし、この方法の適用は、血液中の微量のctDNAを分析する際の感度が低いため、困難です。さらに、このメソッドは、このシーケンスとその後の分析から誤検知と否定的な結果を生成する場合があります。クリニックでのCtDNA検出の実現可能性と信頼性を向上させるために、ここでは、シーケンスのためのまれな変異を豊かにし、まれな突然変異シーケンス（ER-seq）を豊かにする手法を提示します。ER-seqは、1 x 107の野生型ヌクレオチドのうち単一の変異を区別することができます。これにより、非常に低い頻度の遺伝的変化を検出するための有望なツールになり、疾患の異質性の研究に非常に役立ちます。ユニークなシーケンスアダプターのライゲーションにより、この方法により、ctDNA分子の効率的な回復が可能になり、同時に誤りを双方向に修正します（センスとアンチセンス）。1021 KBプローブの選択は、12の腫瘍の腫瘍関連ドライバー変異の95％以上をカバーする標的領域の測定を豊かにします。この費用対効果の高い普遍的な方法により、遺伝データのユニークに成功した蓄積が可能になります。バックグラウンドエラーを効率的にフィルタリングした後、ER-seqはまれな変異を正確に検出できます。ケーススタディを使用して、データ分析ワークフローも含め、プローブの設計、ライブラリの構築、ターゲットDNAキャプチャの方法論を実証する詳細なプロトコルを提示します。この方法を実行するプロセスには、通常1〜2日かかります。

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. However, the application of this method is challenging due to its low sensitivity in analyzing the trace amount of ctDNA in the blood. Furthermore, the method may generate false positive and negative results from this sequencing and subsequent analysis. To improve the feasibility and reliability of ctDNA detection in the clinic, here we present a technique which enriches rare mutations for sequencing, Enrich Rare Mutation Sequencing (ER-Seq). ER-Seq can distinguish a single mutation out of 1 x 107 wild-type nucleotides, which makes it a promising tool to detect extremely low frequency genetic alterations and thus will be very useful in studying disease heterogenicity. By virtue of the unique sequencing adapter's ligation, this method enables an efficient recovery of ctDNA molecules, while at the same time correcting for errors bidirectionally (sense and antisense). Our selection of 1021 kb probes enriches the measurement of target regions that cover over 95% of the tumor-related driver mutations in 12 tumors. This cost-effective and universal method enables a uniquely successful accumulation of genetic data. After efficiently filtering out background error, ER-seq can precisely detect rare mutations. Using a case study, we present a detailed protocol demonstrating probe design, library construction, and target DNA capture methodologies, while also including the data analysis workflow. The process to carry out this method typically takes 1-2 days.