MDFDIA：プロテオームの定量化のための大量欠陥ベースの4プレックスデータに依存しない取得戦略

データに依存しない買収（DIA）は最近、大規模なプロテオーム定量化の強力な定量的アプローチとして浮上し、データ依存の買収（DDA）に敏感で再現可能な代替手段を提供します。ただし、互換性のある多重化された定量化方法の欠如は、DIAのボトルネックです。この課題を緩和するために、タンデム質量分析（MS2）スペクトルの追加の複雑さなしにDIA実験における4つの異なるタンパク質サンプルの並列分析のために、「MDFDIA」と呼ばれる質量欠陥ベースの4プレックスデータに依存しない取得戦略を提示します。MDFDIAは、安定した同位体標識と細胞培養（SILAC）およびジメチル標識のアミノ酸を組み合わせたハイブリッドアプローチです。簡単に言えば、同位体13C615N2-リジン（+8.0142 DA、光）およびD8-リジン（+8.0512 DA、重い）は、細胞培養中の異なるプロテオームサンプルに代謝的に埋め込まれました。次に、2つの13C615N2-リジンとD8-リジン標識タンパク質サンプルをLYS-Cで消化し、続いて軽い（213CD2H、+34.06312 DA）と重い（2CD3、+34.06896 DA）ジメチル基でのin vitro標識を使用しました。標識されたサンプルを等しく混合し、DIAによって分析しました。MS2スキャンの4つのラベル付けされたフォーム間の微妙な質量の違いは、MS2スペクトルにエンコードされた豊富な情報なしに定量化を促進するために、Orbitrap Fusion Lumos機器で解決できます。さらに、体系的な調査が実施され、MDFDIAがクロマトグラフィー同位体効果、特にDDA実験で発生する重水素効果から生じる定量的アッセイの精度に対する悪影響の大幅な減少を可能にすることが明らかになりました。さらに、MDFDIAは、DIAスペクトル識別結果のフラグメントタイプを検証する方法を提供しました。さらに、MDFDIAは、4つの異なる乳癌細胞株の定量的プロテオーム分析に適用され、生物学的応用のこの戦略の実現可能性を実証しました。

Data-independent acquisition (DIA) has recently emerged as a powerful quantitative approach for large-scale proteome quantification, providing a sensitive and reproducible alternative to data-dependent acquisition (DDA). However, lack of compatible multiplexed quantification methods is a bottleneck of DIA. To alleviate this challenge, we present a mass defect based four-plex data-independent acquisition strategy, termed "MdFDIA", for parallel analysis of four different protein samples in a DIA experiment without the additional complexity of tandem mass spectrometry (MS2) spectra. MdFDIA is a hybrid approach that combines stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) and dimethyl labeling. Briefly, the isotopes 13C615N2-lysine (+8.0142 Da, light) and D8-lysine (+8.0512 Da, heavy) were metabolically embedded in different proteome samples during cell culture. Then, two 13C615N2-lysine and D8-lysine labeled protein samples were digested with Lys-C, followed by in vitro labeling with light (213CD2H, +34.06312 Da) and heavy (2CD3, +34.06896 Da) dimethyl groups, respectively, producing four different pseudoisobaric labeled protein samples. The labeled samples were then equally mixed and analyzed by DIA. The subtle mass differences between the four labeled forms in MS2 scans can be resolved on an Orbitrap Fusion Lumos instrument to facilitate quantification without abundance information encoded in MS2 spectra. Additionally, a systematic investigation was carried out and revealed that MdFDIA enabled a significant decrease of the adverse impact on the accuracy of the quantitative assays arising from the chromatographic isotope effect, especially the deuterium effect, which typically occurs in a DDA experiment. Additionally, MdFDIA provided a method for validating the fragment type in the DIA spectra identification result. Furthermore, MdFDIA was applied to quantitative proteome analyses of four different breast cancer cell lines, demonstrating the feasibility of this strategy for biological applications.