子宮内膜上皮細胞への並置は、移植のためにマウス胚盤胞を活性化します

研究の質問：胚盤胞段階の胚と子宮内膜上皮細胞間の相互作用は、in vitroモデルの移植の初期段階をどのように調節しますか？ 概要回答：ヒト子宮内膜上皮細胞とのマウス胚盤胞の並置は、子宮内膜上皮に違反する栄養芽層への栄養骨胚葉分化を開始します。 すでに知られていること：マウス胚盤胞およびヒト子宮内膜細胞株を使用したin vitroモデルは、着床の開始時に子宮内膜上皮への胚付着の分子特性評価においてかけがえのないことが証明されています。子宮内膜上皮の胚違反に関与する遺伝子は、そのようなin vitroモデルでは調査されていません。 研究デザイン、サイズ、期間：この研究では、子宮内膜上皮細胞への胚盤胞付着中の細胞および分子相互作用を調べるために、確立されたin vitroモデルを使用しました。 参加者/材料、設定、方法：胚の日（E）1.5から発生したマウス胚盤胞は、血清を含まない培地中の合流体子宮内膜腺癌由来石川細胞と協調して培養されました。攪拌時の胚盤胞振動に基づく付着安定性の規模が考案されました。胚盤胞を48時間監視して移植の速度論を確立し、蛍光顕微鏡を使用した光学断片化により、付着と浸潤界面が明らかになりました。定量的PCRを使用して、胚盤胞遺伝子発現を決定しました。合計680個のマウス胚盤胞からのデータが報告されており、3〜6個の実験的複製があります。t検定とANOVAは、P <0.05、P <0.01およびP <0.001で確立された統計的有意性を分析します。 主な結果と偶然の役割：hatch化したE4.5マウス胚盤胞は、共培養の最初の24時間でフィルエントな石川細胞に弱い愛着を示し、中間および安定した付着は28時間（E5.5 + 4時間）から発生します。ホルモンに依存しない方法。48時間後に固定された結合胚（E6.5）は、形態学的に特徴づけられ、抗体マーカーを栄養芽細胞の巨大細胞（TGC）として特徴づけ、石川細胞層に違反していた胚を頻繁に示しました。E5.5での共培養を開始すると、E5.5 + 4時間から中間および安定した付着がもたらされました。ただし、共培養がE7.5に拡張された場合でも、これらの胚は石川細胞層に違反することはありませんでした（P <0.01）。e4.5から透過性トランスウェルインサートで培養された胚盤胞は石川細胞の上に培養され、E5.5で直接共培養に移行する前に培養しましたが、E6.5（P <0.01）で石川細胞層を破ることができませんでした。E5.5での遺伝子発現分析は、E4.5の石川細胞との直接共培養により、栄養皮筋転写因子CDX2（P <0.05）およびGATA3（P <0.05）のダウンレギュレーションをもたらし、TGC転写因子Hand1（Pのアップレギュレーションをもたらすことが示されました。<0.05）。非内在性ヒト線維芽細胞との共培養は、これらの遺伝子の発現を変化させませんでした。 大規模なデータ：なし。 制限、注意の理由：ここで使用されるin vitroモデルは、ヒト癌由来子宮内膜細胞とマウス胚を組み合わせています。観察された細胞相互作用は、in vivoで完全に再現できない場合があります。このようなモデルから収集されたデータは、仮説を生成すると見なすことができ、複数の原発性子宮内膜細胞タイプと代理胚および実際のヒト胚を組み合わせたヒト移植のより洗練されたモデルを開発するには、現在、研究が必要です。 調査結果のより広い意味：この研究は、着床に必要な栄養芽層分化の重要なステップとして、子宮内膜上皮細胞への胚盤胞の並置を含むことを示しています。胚発生プログラムのこの母体の調節を理解することは、不妊症の新しい治療につながる可能性があります。 研究資金と競合する利益：この作業は、女性の慈善団体（RG1442）と糖尿病英国（15/0005207）からの資金、および解剖学会からのSCBの学生支援によってサポートされていました。利益相反は宣言されていません。

STUDY QUESTION: How do interactions between blastocyst-stage embryos and endometrial epithelial cells regulate the early stages of implantation in an in vitro model? SUMMARY ANSWER: Mouse blastocyst apposition with human endometrial epithelial cells initiates trophectoderm differentiation to trophoblast, which goes on to breach the endometrial epithelium. WHAT IS KNOWN ALREADY: In vitro models using mouse blastocysts and human endometrial cell lines have proven invaluable in the molecular characterisation of embryo attachment to endometrial epithelium at the onset of implantation. Genes involved in embryonic breaching of the endometrial epithelium have not been investigated in such in vitro models. STUDY DESIGN, SIZE, DURATION: This study used an established in vitro model of implantation to examine cellular and molecular interactions during blastocyst attachment to endometrial epithelial cells. PARTICIPANTS/MATERIALS, SETTING, METHODS: Mouse blastocysts developed from embryonic day (E) 1.5 in vitro were hatched and co-cultured with confluent human endometrial adenocarcinoma-derived Ishikawa cells in serum-free medium. A scale of attachment stability based on blastocyst oscillation upon agitation was devised. Blastocysts were monitored for 48 h to establish the kinetics of implantation, and optical sectioning using fluorescence microscopy revealed attachment and invasion interfaces. Quantitative PCR was used to determine blastocyst gene expression. Data from a total of 680 mouse blastocysts are reported, with 3-6 experimental replicates. T-test and ANOVA analyses established statistical significance at P < 0.05, P < 0.01 and P < 0.001. MAIN RESULTS AND THE ROLE OF CHANCE: Hatched E4.5 mouse blastocysts exhibited weak attachment to confluent Ishikawa cells over the first 24 h of co-culture, with intermediate and stable attachment occurring from 28 h (E5.5 + 4 h) in a hormone-independent manner. Attached embryos fixed after 48 h (E6.5) frequently exhibited outgrowths, characterised morphologically and with antibody markers as trophoblast giant cells (TGCs), which had breached the Ishikawa cell layer. Beginning co-culture at E5.5 also resulted in intermediate and stable attachment from E5.5 + 4 h; however, these embryos did not go on to breach the Ishikawa cell layer, even when co-culture was extended to E7.5 (P < 0.01). Blastocysts cultured from E4.5 in permeable transwell inserts above Ishikawa cells before transfer to direct co-culture at E5.5 went on to attach but failed to breach the Ishikawa cell layer by E6.5 (P < 0.01). Gene expression analysis at E5.5 demonstrated that direct co-culture with Ishikawa cells from E4.5 resulted in downregulation of trophectoderm transcription factors Cdx2 (P < 0.05) and Gata3 (P < 0.05) and upregulation of the TGC transcription factor Hand1 (P < 0.05). Co-culture with non-endometrial human fibroblasts did not alter the expression of these genes. LARGE SCALE DATA: None. LIMITATIONS, REASONS FOR CAUTION: The in vitro model used here combines human carcinoma-derived endometrial cells with mouse embryos, in which the cellular interactions observed may not fully recapitulate those in vivo. The data gleaned from such models can be regarded as hypothesis-generating, and research is now needed to develop more sophisticated models of human implantation combining multiple primary endometrial cell types with surrogate and real human embryos. WIDER IMPLICATIONS OF THE FINDINGS: This study implicates blastocyst apposition to endometrial epithelial cells as a critical step in trophoblast differentiation required for implantation. Understanding this maternal regulation of the embryonic developmental programme may lead to novel treatments for infertility. STUDY FUNDING AND COMPETING INTEREST(S): This work was supported by funds from the charities Wellbeing of Women (RG1442) and Diabetes UK (15/0005207), and studentship support for SCB from the Anatomical Society. No conflict of interest is declared.