結合誘導放出状態の安定化により、蛍光タンパク質スイッチング疲労を減少させる

このイメージングのパフォーマンスは、ラベルの特性に決定的に依存していますが、可逆スイッチの蛍光タンパク質（RSFPS）が高度な蛍光イメージングを可能にします。エンハンサーという名前の既存の小さな結合ペプチドの使用について報告し、最近開発されたRSFPSのRSGREENシリーズの分光特性を調節します。RSGREEN1およびRSGREENFを使用したエンハンサーの融合コンストラクトは、分子の明るさとpH安定性の増加を明らかにしましたが、生きている大腸菌またはHELA細胞での発現は、全体的な放出の減少をもたらしました。驚くべきことに、エンハンサーの結合は、スイッチング速度とスイッチング疲労に対する抵抗も増加させました。さらなる調査では、RSFPが速いスイッチとスロースイッチの放射状態を相互変換し、全体的なタンパク質集団が照射を介して徐々にスロースイッチング状態に徐々に変換されることが示唆されました。エンハンサーは、両方の状態の分光特性を調節しますが、疲労抵抗の増加をサポートする高速スイッチ状態を優先的に安定させます。この研究は、RSFPの光物理的特性が他の小さなタンパク質への結合によってどのように影響を受けるかを示しています。さらに、改善または異なるフォトクロミック特性を備えた新しいRSFPを開発する際に、一般的な考慮事項である写真スイッチの速度論に関する新しい洞察を提供します。

Reversibly switchable fluorescent proteins (RSFPs) enable advanced fluorescence imaging, though the performance of this imaging crucially depends on the properties of the labels. We report on the use of an existing small binding peptide, named Enhancer, to modulate the spectroscopic properties of the recently developed rsGreen series of RSFPs. Fusion constructs of Enhancer with rsGreen1 and rsGreenF revealed an increased molecular brightness and pH stability, although expression in living E. coli or HeLa cells resulted in a decrease of the overall emission. Surprisingly, Enhancer binding also increased off-switching speed and resistance to switching fatigue. Further investigation suggested that the RSFPs can interconvert between fast- and slow-switching emissive states, with the overall protein population gradually converting to the slow-switching state through irradiation. The Enhancer modulates the spectroscopic properties of both states, but also preferentially stabilizes the fast-switching state, supporting the increased fatigue resistance. This work demonstrates how the photo-physical properties of RSFPs can be influenced by their binding to other small proteins, which opens up new horizons for applications that may require such modulation. Furthermore, we provide new insights into the photoswitching kinetics that should be of general consideration when developing new RSFPs with improved or different photochromic properties.