無症状溶血がLVAD血栓症に寄与するという臨床的およびin vitroでの証拠

背景：最近のデータは、溶血が左心室補助装置（LVAD）血栓症に寄与することを示唆していますが、メカニズムは不明です。臨床研究では、血漿を含まないヘモグロビン（PFHGB）とLVAD血栓症の発生率を測定しました。in vitroの研究では、LVAD血栓症のメカニズムを理解するためのせん断応力、PFHGBおよびVon Willebrand因子（VWF）代謝の生物物理学的関係を調べました。 方法：臨床研究では、血液サンプルが連続流量LVAD患者から得られました（n = 30）。血漿を含まないヘモグロビンは、酵素結合免疫吸着アッセイを介して測定されました。血漿乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）を蛍光アッセイで測定しました。in vitroの研究では、メカニズムを調査するために、ヒト血漿（n = 10）を、遊離ヘモグロビン（30 mg/dl）を持つまたは伴わずにLVAD様せん断応力（175 Dyne/cm2）にさらされました。ADAMTS-13（VWFプロテアーゼ）活性は、フェルスター共鳴エネルギー移動により定量化されました。VWFサイズは、免疫ブロットで定量化されました。VWF凝固関数は、酵素結合免疫吸着剤アッセイで定量化されました。 結果：臨床研究では、LVADのサポートが無症状の溶血を引き起こしました。すべての患者で、LDHは10日間の支持（P <0.0001）で213±9 U/Lから366±31 U/Lに大幅に増加し、1か月のサポート（P <0.01）で280±18 U/Lで有意に上昇したままでした。LVAD血栓症を発症しなかった21人の患者では、PFHGBは早期に増加したが、時間の経過とともに減少した（5.2±0.8 mg/dl; 1週：19.8±4.4 mg/dl、p <0.01; 3ヶ月：9.3±2.2 mg/dl、p = 0.07）。LVAD血栓症を発症した9人の患者では、PFHGBが血栓症のない患者（P <0.001）および3か月（P <0.05）の支持（P <0.05）の後（PRE-LVAD：20.2±6.3 mg/dL; 1週：17.3±3.7 mg/dL; 3ヶ月：21.5±7.8 mg/dl）。同様に、3か月後、LVAD血栓症を発症しなかった患者のLDHは271±28 U/Lでしたが、後にLVAD血栓症を発症した患者は625±210 U/LのLDHが有意に高い（P = 0.02）。in vitro研究では、せん断応力はLVADと同様にVWFを分解しました。遊離ヘモグロビンは、せん断ストレス中にAdamts-13活性を阻害しました（633±27 ng/mlから565±24 ng/ml; P <0.001）。それにより、VWFは分解から保護され、4つのVWFフラグメントが大幅に減少し（p≤0.05）、VWF凝固関数が増加しました（1.15±0.09 U/mLから1.29±0.09 U/ml、P = 0.06）。 結論：これらは、連続流量LVADサポート中に、症状溶血と凝固剤状態との間の機械的関係を示す最初のデータです。PFHGBとLDHが高い患者は、LVAD血栓症を発症する可能性が高かった。in vitro実験により、遊離ヘモグロビンがADAMTS-13を阻害し、VWFを分解から保護し、VWF凝固機能の増加を阻害し、凝固剤状態を作成することが実証されました。そのため、PFHGBはLVAD血栓症を予防するための臨床標的である可能性があります。

BACKGROUND: Recent data suggest that hemolysis contributes to left ventricular assist device (LVAD) thrombosis, but the mechanism is unknown. In a clinical study, we measured plasma free hemoglobin (pfHgb) and the incidence of LVAD thrombosis. In an in vitro study, we examined biophysical relationships between shear stress, pfHgb and von Willebrand factor (vWF) metabolism toward understanding mechanisms of LVAD thrombosis. METHODS: In the clinical study, blood samples were obtained from continuous-flow LVAD patients (n = 30). Plasma free hemoglobin was measured via enzyme-linked immunosorbent assay. Plasma lactate dehydrogenase (LDH) was measured with a fluorimetric assay. In the in vitro study, to investigate mechanism, human plasma (n = 10) was exposed to LVAD-like shear stress (175 dyne/cm2) with and without free hemoglobin (30 mg/dL). ADAMTS-13 (the vWF protease) activity was quantified with Förster resonance energy transfer. vWF size was quantified with immunoblotting. vWF clotting function was quantified with an enzyme-linked immunosorbent assay. RESULTS: In the clinical study, LVAD support caused subclinical hemolysis. In all patients, LDH increased significantly from 213 ± 9 U/L to 366 ± 31 U/L at 10 days of support (p < 0.0001) and remained significantly elevated at 280 ± 18 U/L at 1 month of support (p < 0.01). In 21 patients that did not develop LVAD thrombosis, pfHgb increased early but decreased over time (pre-LVAD: 5.2 ± 0.8 mg/dL; 1 week: 19.8 ± 4.4 mg/dL, p < 0.01; 3 months: 9.3 ± 2.2 mg/dL, p = 0.07). In 9 patients that developed LVAD thrombosis, pfHgb was significantly elevated versus patients without thrombosis before (p < 0.001) and after 3 months (p < 0.05) of support (pre-LVAD: 20.2 ± 6.3 mg/dL; 1 week: 17.3 ± 3.7 mg/dL; 3 months: 21.5 ± 7.8 mg/dL). Similarly, after 3 months, patients that did not develop LVAD thrombosis had an LDH of 271 ± 28 U/L, whereas patients that later developed LVAD thrombosis had a significantly higher LDH of 625 ± 210 U/L (p = 0.02). In the in vitro study, shear stress degraded vWF similarly to an LVAD. Free hemoglobin inhibited ADAMTS-13 activity during shear stress (633 ± 27 ng/mL to 565 ± 24 ng/mL; p < 0.001). vWF was thereby protected from degradation, 4 vWF fragments decreased significantly (p ≤ 0.05), and vWF clotting function increased (1.15 ± 0.09 U/mL to 1.29 ± 0.09 U/mL, p = 0.06). CONCLUSIONS: These are the first data to demonstrate mechanistic relationships between subclinical hemolysis and a procoagulant state during continuous-flow LVAD support. Patients with high pfHgb and LDH were more likely to develop LVAD thrombosis. In vitro experiments demonstrated that free hemoglobin inhibited ADAMTS-13, protected vWF from degradation, increased vWF clotting function, and created a procoagulant state. As such, pfHgb may be a clinical target to prevent LVAD thrombosis.