Agrobacterium Tumefaciensを介した変換：Talaromyces Marneffeiの標的遺伝子破壊のための効率的なツール

Talaromyces Marneffeiは、免疫不全の宿主に生命を脅かす感染を引き起こします。T. marneffeiの遺伝的操作のための効率的なツールは、この熱的な二形性真菌の理解を高めることができます。Agrobacterium Tumefaciensを介した形質転換（ATMT）は、プラスミドPDHT/ACUD :: PYRGを使用して、T。marneffeiの標的遺伝子破壊のために最適化されました。形質転換体の分子分析は、PCR、サザンブロット、および半定量的RT-PCRによって実行されました。A. Tumefaciens株EHA105は、固体共栽培を介してATMTのAGL-1株よりも変換により効率的でした。A. tumefaciens：t。Marneffei比は、ATMT液体の共培養で1000：1の比率で、106酵母細胞あたり90の形質転換体の変換効率が比較的高くなりました。ATMTを介したノックアウト変異誘発を使用して、T。marneffeiのACUD遺伝子を正常に削除しました。PCRおよびサザンブロット分析により、ACUDが破壊され、外来PYRG遺伝子がT. Marneffeiに統合されたことが確認されました。半定量的RT-PCR分析により、Pyrgが正常に発現していることがさらに確認されました。これらの結果は、ATMTがT. marneffeiの標的遺伝子破壊の潜在的なプラットフォームであり、液体の共培養が臨床治療を開発する新しい機会を提供する可能性があることを示唆しています。

Talaromyces marneffei causes life-threatening infections in immunocompromised hosts. An efficient tool for genetic manipulation of T. marneffei will allow for increased understanding of this thermally dimorphic fungus. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (ATMT) was optimized for targeted gene disruption in T. marneffei using the plasmid pDHt/acuD::pyrG. Molecular analyses of transformants were performed by PCR, Southern blot and semi-quantitative RT-PCR. A. tumefaciens strain EHA105 was more efficient at transformation than strain AGL-1 in ATMT via solid co-cultivation. An A. tumefaciens:T. marneffei ratio of 1000:1 in an ATMT liquid co-cultivation led to a relatively high transformation efficiency of 90 transformants per 106 yeast cells. Using ATMT-mediated knockout mutagenesis, we successfully deleted the acuD gene in T. marneffei. PCR and Southern blot analysis confirmed that acuD was disrupted and that the foreign pyrG gene was integrated into T. marneffei. Semi-quantitative RT-PCR analysis further confirmed that pyrG was expressed normally. These results suggest that ATMT can be a potential platform for targeted gene disruption in T. marneffei and that liquid co-cultivation may provide new opportunities to develop clinical treatments.