酵母のミトコンドリアATPaseのベータサブユニットのアルギニン328は、タンパク質の安定性に不可欠です

ミトコンドリアATPaseは、アルギニン選択試薬フェニルグリオキサールによって急速に不活性化されます。最近、葉緑体酵素（Viale、A。M.、およびVallejos、R。H.（1985）J。Biol。Chem。260、4958-4962）について、葉緑体酵素（Viale、A。M.）について主要な反応残基が報告されています。このアルギニン残基は、ATPaseの活性部位にあると結論付けられ、おそらくヌクレオチドの結合に関与しました。この仮説をテストするために、酵母酵素の部位指向変異誘発は、Arg-328をアラニンおよびリジンに置き換えるために使用されています。修飾された遺伝子は、ATPaseのベータサブユニットをコードする遺伝子にヌル変異を含む酵母株DMY111に変換されました。両方の置換は、酵母形質転換体が非発酵性炭素源で成長する能力によって実証されているように、in vivoで機能的でした。ALA-328およびLYS-328を搭載した水溶性F1-ATPaseは非常に不安定でしたが、グリセロールでは安定化できました。酵素崩壊の速度は、ALA-328およびLys-328がそれぞれ10％と5％グリセロールで1.1および4.0分の半減期を伴う一次速度論に続いていましたが、野生型酵素はグリセロールの存在下でも安定していました。ATPaseとGTPaseの両方の運動分析が決定されています。野生型酵素には、0.056 mm-1および67単位/min/mg、0.140 mm-1および100単位/min/mgのATPaseの2つの観察可能な見かけのkmとVmax値がありました。Lys-328を含む変異酵素は、0.066 mm-1および23単位/min/mg、0.300 mm-1および43単位/min/mgの同様の運動値を示しました。ただし、ALA-328を含む変異酵素は、0.121 mm-1および45単位/min/mgの値を持つ単一の部位のみを実証しました。ATPase活性とは対照的に、GTPaseの運動値は、野生型および変異酵素でほぼ同一でした。予測された結果とは反対に、変異酵素は試薬フェニルグリオキサールに対してより敏感でした。これらの結果は、ARG-328がタンパク質の安定性にとって重要であるが、触媒には関与していないことを示しています。

The mitochondrial ATPase is rapidly inactivated by the arginine selective reagent phenylglyoxal. Recently, the purported major reacting residue has been reported for the chloroplast enzyme (Viale, A. M., and Vallejos, R. H. (1985) J. Biol. Chem. 260, 4958-4962) corresponding to Arg-328 in the beta-subunit of the yeast Saccharomyces cerevisiae mitochondrial ATPase, a highly conserved residue in the ATPase. This arginine residue was concluded to be in the active site of the ATPase and possibly involved in the binding of nucleotides. To test this hypothesis, site-directed mutagenesis of the yeast enzyme has been used to replace Arg-328 with alanine and lysine. The modified genes were transformed into a yeast strain, DMY111, which contained a null mutation in the gene coding for the beta-subunit of the ATPase. Both of the substitutions were functional in vivo as demonstrated by the ability of yeast transformants to grow on a nonfermentable carbon source. The water soluble F1-ATPase with Ala-328 and Lys-328 were extremely unstable, but could be stabilized with glycerol. The rate of enzymatic decay followed first order kinetics with half-lives of 1.1 and 4.0 min for the mutants with Ala-328 and Lys-328 in 10% and 5% glycerol, respectively, while the wild type enzyme was stable even in the absence of glycerol. Kinetic analysis of both ATPase and GTPase has been determined. The wild type enzyme had two observable apparent Km and Vmax values for ATPase which were 0.056 mM-1 and 67 units/min/mg and 0.140 mM-1 and 100 units/min/mg. The mutant enzyme containing Lys-328 showed similar kinetic values of 0.066 mM-1 and 23 units/min/mg and 0.300 mM-1 and 43 units/min/mg. The mutant enzyme containing Ala-328, however, only demonstrated a single site with values of 0.121 mM-1 and 45 units/min/mg. In contrast to ATPase activity, kinetic values for GTPase were nearly identical for the wild type and mutant enzymes. Opposite to predicted results, the mutant enzymes were more sensitive to the reagent phenylglyoxal. These results indicate that Arg-328 is important for protein stability, but not involved in catalysis.