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アポトーシスタンパク質ファミリーの阻害剤であるサバイビンは、診断と予後の強力な腫瘍マーカーです。酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）は、サバイビンの検出に使用されている方法の1つです。しかし、ELISAには従来の抗体の使用によって引き起こされるいくつかの欠点があるため、有利な置換としてラクダリッド単一ドメイン抗体（VHHS）を使用して新しいELISAシステムを開発しようとしています。ここでは、サバイビン検出のためにVHHポリクローナル抗体サンドイッチELISAを改善するための補足アプローチを報告します。ヨードアセチル官能化プルランが合成され、そのチオール反応性はL-システインとのモデル反応によって特徴付けられました。チオフィリ酸プルランは、抗サルビビンVHH融合タンパク質とC末端システインを備えた標準アッセイプレートのコーティング時に、免疫アッセイアサン添加物に適用されました。結果は、VHHに対する添加剤のモル比が結果として生じる反応に大きな影響を与えることを示しました。0.07、0.7、および7のモル比は、添加剤が使用されなかった陽性対照の応答よりも、それぞれ90％低く、15％高く、69％低い応答をもたらしました。添加剤条件で観察されるバックグラウンドレベルは、VHHと添加剤の両方を欠くネガティブコントロールのバックグラウンドレベルと同じくらい低かった。これらの結果は、VHHベースのELISAに対する応答エンハンサーとしてのチオール反応性プルランの適用性を示しています。
アポトーシスタンパク質ファミリーの阻害剤であるサバイビンは、診断と予後の強力な腫瘍マーカーです。酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）は、サバイビンの検出に使用されている方法の1つです。しかし、ELISAには従来の抗体の使用によって引き起こされるいくつかの欠点があるため、有利な置換としてラクダリッド単一ドメイン抗体（VHHS）を使用して新しいELISAシステムを開発しようとしています。ここでは、サバイビン検出のためにVHHポリクローナル抗体サンドイッチELISAを改善するための補足アプローチを報告します。ヨードアセチル官能化プルランが合成され、そのチオール反応性はL-システインとのモデル反応によって特徴付けられました。チオフィリ酸プルランは、抗サルビビンVHH融合タンパク質とC末端システインを備えた標準アッセイプレートのコーティング時に、免疫アッセイアサン添加物に適用されました。結果は、VHHに対する添加剤のモル比が結果として生じる反応に大きな影響を与えることを示しました。0.07、0.7、および7のモル比は、添加剤が使用されなかった陽性対照の応答よりも、それぞれ90％低く、15％高く、69％低い応答をもたらしました。添加剤条件で観察されるバックグラウンドレベルは、VHHと添加剤の両方を欠くネガティブコントロールのバックグラウンドレベルと同じくらい低かった。これらの結果は、VHHベースのELISAに対する応答エンハンサーとしてのチオール反応性プルランの適用性を示しています。
Survivin, an inhibitor of the apoptosis protein family, is a potent tumor marker for diagnosis and prognosis. The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is one of the methods that has been used for detection of survivin. However, ELISA has several disadvantages caused by the use of conventional antibodies, and we have therefore been trying to develop a novel ELISA system using camelid single-domain antibodies (VHHs) as advantageous replacements. Here we report a supplemental approach to improve the VHH-polyclonal antibody sandwich ELISA for survivin detection. Iodoacetyl-functionalized pullulan was synthesized, and its thiol reactivity was characterized by a model reaction with l-cysteine. The thiophilic pullulan was applied to an immunoassay asan additive upon coating of standard assay plates with an anti-survivin VHH fusion protein with C-terminal cysteine. The results showed that the mole ratio of the additive to VHH had a significant effect on the consequent response. Mole ratios of 0.07, 0.7, and 7 led to 90% lower, 15% higher, and 69% lower responses, respectively, than the response of a positive control in which no additive was used. The background levels observed in any additive conditions were as low as that of a negative control lacking both VHH and the additive. These results indicate the applicability of the thiol-reactive pullulan as a response enhancer to VHH-based ELISA.
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