長い読みた単一分子を使用したDNAメチル化プロファイリングリアルタイムビスル酸塩シーケンス（SMRT-BS）

過去20年間、胆汁産のシーケンスは、ゲノムDNAの定量的CPGメチル化検出のために広く使用されている方法でした。PCR Ampliconクローニングと相まって、ビスライトサンガーシーケンスにより、対立遺伝子特異的CPGメチル化評価が可能になります。ただし、その時間のかかるプロトコルと多重化不能が最近、次世代のビスル酸塩シーケンス技術によって克服されました。ハイスループットシーケンスプラットフォームは、ビスル酸塩シーケンス深度の増加の結果としてCPGメチル化の定量の精度を高めることができますが、最も一般的なシーケンスプラットフォームは、典型的なビスライトPCRサイズ範囲（〜300〜500 bp）と類似した読み取りを生成します。Pacific Biosciences（PACBIO）シーケンスプラットフォームを使用して、単一分子リアルタイムビスル酸塩シーケンス（SMRT-BS）を開発しました。SMRT-BSは再現性があり、他の低いスループットの定量的CPGメチル化法と一致していることがわかりました。さらに、最適化されたビゾル酸塩変換プロトコルと組み合わせた場合、最大1.5〜2.0 kbのアンプリコンをシーケンスする能力により、CPG島のより徹底的な評価が可能になり、単一ヌクレオチド変異体と対立遺伝子特異的CPG間の関係を研究する能力が向上します。メチル化。

For the past two decades, bisulfite sequencing has been a widely used method for quantitative CpG methylation detection of genomic DNA. Coupled with PCR amplicon cloning, bisulfite Sanger sequencing allows for allele-specific CpG methylation assessment; however, its time-consuming protocol and inability to multiplex has recently been overcome by next-generation bisulfite sequencing techniques. Although high-throughput sequencing platforms have enabled greater accuracy in CpG methylation quantitation as a result of increased bisulfite sequencing depth, most common sequencing platforms generate reads that are similar in length to the typical bisulfite PCR size range (~300-500 bp). Using the Pacific Biosciences (PacBio) sequencing platform, we developed single molecule real-time bisulfite sequencing (SMRT-BS), which is an accurate targeted CpG methylation analysis method capable of a high degree of multiplexing and long read lengths. SMRT-BS is reproducible and was found to be concordant with other lower throughput quantitative CpG methylation methods. Moreover, the ability to sequence up to ~1.5-2.0 kb amplicons, when coupled with an optimized bisulfite-conversion protocol, allows for more thorough assessment of CpG islands and increases the capacity for studying the relationship between single nucleotide variants and allele-specific CpG methylation.