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D. Squalensは、本質的にリグノセルロースを効率的に分解する白い路線菌であり、さまざまなバイオテクノロジー用途で使用でき、シーケンスおよび注釈付きゲノムを備えたいくつかの株を持っています。ここでは、最近導入された市販の子嚢菌プロトプラスト酵素カクテル、プロトプラストFを使用して、このbasidiOmycete菌の変換のための方法を提示します。。プロトプラストFを使用して放出されたプロトプラストの再生率は12.5％（±6 SE）でした。プロトプラストFを使用して、D。squalensMonokaryon CBS464.89は、抗生物質ヒグロマイシンおよびG418に対する耐性を与えられ、ポリエチレングリコール媒介プロトプラスト形質転換を介して耐性カセットを介してヒグロマイシンホスホランフェールゼ（HPH）とネオマイシンphosphotransereeraseを発現する耐性カセットを介して授与されました。HPH遺伝子は、β-チューブリンまたはグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子からの異種プロモーターを使用して、D。squalensで発現しました。サザンブロットにより、抵抗カセットのD. squalensゲノムへの統合が確認されました。少なくとも数百万個のプロトプラストを使用した場合、平均6つの形質転換体（±2 SE）が得られました（DNAあたり0.8（±0.3 SE）形質転換体）。D. squalensの形質転換は、basidioMyceteの変換に対するプロトプラストFカクテルの適合性を示し、さらに、ベシジオマイセット遺伝子機能の理解とバイオテクノロジー応用の改善株の発達を促進することができます。
D. Squalensは、本質的にリグノセルロースを効率的に分解する白い路線菌であり、さまざまなバイオテクノロジー用途で使用でき、シーケンスおよび注釈付きゲノムを備えたいくつかの株を持っています。ここでは、最近導入された市販の子嚢菌プロトプラスト酵素カクテル、プロトプラストFを使用して、このbasidiOmycete菌の変換のための方法を提示します。。プロトプラストFを使用して放出されたプロトプラストの再生率は12.5％（±6 SE）でした。プロトプラストFを使用して、D。squalensMonokaryon CBS464.89は、抗生物質ヒグロマイシンおよびG418に対する耐性を与えられ、ポリエチレングリコール媒介プロトプラスト形質転換を介して耐性カセットを介してヒグロマイシンホスホランフェールゼ（HPH）とネオマイシンphosphotransereeraseを発現する耐性カセットを介して授与されました。HPH遺伝子は、β-チューブリンまたはグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子からの異種プロモーターを使用して、D。squalensで発現しました。サザンブロットにより、抵抗カセットのD. squalensゲノムへの統合が確認されました。少なくとも数百万個のプロトプラストを使用した場合、平均6つの形質転換体（±2 SE）が得られました（DNAあたり0.8（±0.3 SE）形質転換体）。D. squalensの形質転換は、basidioMyceteの変換に対するプロトプラストFカクテルの適合性を示し、さらに、ベシジオマイセット遺伝子機能の理解とバイオテクノロジー応用の改善株の発達を促進することができます。
D. squalens, a white-rot fungus that efficiently degrades lignocellulose in nature, can be used in various biotechnological applications and has several strains with sequenced and annotated genomes. Here we present a method for the transformation of this basidiomycete fungus, using a recently introduced commercial ascomycete protoplasting enzyme cocktail, Protoplast F. In protoplasting of D. squalens mycelia, Protoplast F outperformed two other cocktails while releasing similar amounts of protoplasts to a third cocktail. The protoplasts released using Protoplast F had a regeneration rate of 12.5% (±6 SE). Using Protoplast F, the D. squalens monokaryon CBS464.89 was conferred with resistance to the antibiotics hygromycin and G418 via polyethylene glycol mediated protoplast transformation with resistance cassettes expressing the hygromycin phosphotransferase (hph) and neomycin phosphotransferase (nptII) genes, respectively. The hph gene was expressed in D. squalens using heterologous promoters from genes encoding β-tubulin or glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase. A Southern blot confirmed integration of a resistance cassette into the D. squalens genome. An average of six transformants (±2 SE) were obtained when at least several million protoplasts were used (a transformation efficiency of 0.8 (±0.3 SE) transformants per μg DNA). Transformation of D. squalens demonstrates the suitability of the Protoplast F cocktail for basidiomycete transformation and furthermore can facilitate understanding of basidiomycete gene function and development of improved strains for biotechnological applications.
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