一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド媒介遺伝子修復実験におけるオフターゲットイベントのゲノムワイドマッピング

短い一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドは、異なる用途で使用される汎用性の高い分子ツールです。それらは遺伝子修復とゲノム編集を可能にし、アンチセンス技術の中心です。一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドの使いやすさは、その効率とその特異性に依存するため、遺伝毒性の標的オフターゲット活動を分析することが重要です。したがって、標的ゲノムへの物理的取り込みに基づいて、ヒト細胞におけるビオチン標識一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドの運命に続くプロトコルを開発しました。罹患した染色体断片は濃縮され、できればナノポアシーケンスによってシーケンスされます。このプロトコルは、DNA二本鎖切断を意図的に誘導することなく、遺伝子修復実験で検証されました。21-ヌクレオチド長にわたるホスホロチオエート修飾オリゴデオキシノクレオチドの場合、HEK293由来の細胞を活発に除算することから、誤った誤差の組み込み、点変異、インデル、および構造的再編成を編集しました。さらに、内因性CybB軌跡に向けられた100ヌクレオチドの長さの未修飾オリゴデオキシヌクレオチドでヒトCD34+造血幹および前駆細胞を処理することにより、一次細胞に対するこのアプローチの有用性を実証しました。この作業は、将来の遺伝毒性分析への道を開くはずです。ヌクレアーゼ誘発DNA二本鎖切断に基づくゲノム工学アプローチに関して、このプロトコルは、ドナーの断片自体によって引き起こされる不要な効果を検出するのに役立ちます。

Short single-stranded oligodeoxynucleotides are versatile molecular tools used in different applications. They enable gene repair and genome editing, and they are central to the antisense technology. Because the usability of single-stranded oligodeoxynucleotides depends on their efficiencies, as well as their specificities, analyzing their genotoxic off-target activities is important. Thus, we have developed a protocol that follows the fate of a biotin-labeled single-stranded oligodeoxynucleotide in human cells based on its physical incorporation into the targeted genome. Affected chromosomal fragments are enriched and preferably sequenced by nanopore sequencing. This protocol was validated in gene repair experiments without intentionally inducing a DNA double-strand break. For a 21-nucleotide-long phosphorothioate-modified oligodeoxynucleotide, we compiled a broad array of error-free incorporations, point mutations, indels, and structural rearrangements from actively dividing HEK293-derived cells. Additionally, we demonstrated the usefulness of this approach for primary cells by treating human CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells with a 100-nucleotide-long unmodified oligodeoxynucleotide directed against the endogenous CYBB locus. This work should pave the way for future genotoxicity analyses. Concerning genome engineering approaches based on nuclease-induced DNA double-strand breaks, this protocol could aid in detecting the unwanted effects caused by the donor fragments themselves.