DNAに沿った分子の輸送を研究するためのシンプルで堅牢な単一分子フローストレッチアッセイの実装

DNAに沿った分子の1D拡散を研究するための、単純で堅牢で高スループットの単一分子フローストレッチアッセイについて説明します。このアッセイでは、ガラスのカバースリップは、シラン - ペジ - ビオチンとのワンステップ反応で機能化されます。フローセルは、機能化されたカバースリップとインレットとアウトレットホールを含むPDMSスラブの間に事前にカットされたチャネルを備えた接着テープをサンドイッチすることにより構築されます。複数のチャネルが1つのフローセルに統合され、各チャネルへの試薬の流れは完全に自動化でき、アッセイスループットを大幅に増加させ、アッセイごとの実践時間を短縮します。各チャネル内では、ビオチン-λ-DNAが表面に固定され、DNAを流れるために層流が適用されます。DNA分子は、輪郭の長さの80％以上に伸び、蛍光標識分子の結合および輸送活性を研究するための空間的に拡張されたテンプレートとして機能します。単一分子の軌跡は、タイムラプス全体の内部反射蛍光（TIRF）イメージングによって追跡されます。RAW画像は、合理化されたカスタムシングル粒子追跡ソフトウェアを使用して分析され、DNAに沿って拡散する単一分子の軌跡を自動的に識別し、1D拡散定数を推定します。

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, glass coverslips are functionalized in a one-step reaction with silane-PEG-biotin. Flow cells are constructed by sandwiching an adhesive tape with pre-cut channels between a functionalized coverslip and a PDMS slab containing inlet and outlet holes. Multiple channels are integrated into one flow cell and the flow of reagents into each channel can be fully automated, which significantly increases the assay throughput and reduces hands-on time per assay. Inside each channel, biotin-λ-DNAs are immobilized on the surface and a laminar flow is applied to flow-stretch the DNAs. The DNA molecules are stretched to >80% of their contour length and serve as spatially extended templates for studying the binding and transport activity of fluorescently labeled molecules. The trajectories of single molecules are tracked by time-lapse Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) imaging. Raw images are analyzed using streamlined custom single particle tracking software to automatically identify trajectories of single molecules diffusing along DNA and estimate their 1D diffusion constants.