可溶性原核生物の発現と生物活性腫瘍壊死因子関連のアポトーシス誘導リガンドの精製

腫瘍壊死因子関連のアポトーシス誘発リガンド（TRAIL）は、ほとんどの正常細胞に向かって毒性を伝えることなく癌細胞のアポトーシスを誘導する能力により、抗腫瘍剤と見なされます。トレイルは、大腸菌の細胞質における不溶性発現のために、低い収量で生成されます。この研究では、トレイルのN末端でマルトース結合タンパク質（MBP）、B'A 'ドメイン、またはタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを融合することにより、TRAILの可溶性発現を達成しました。トレイルは、その後の固定化された金属アフィニティークロマトグラフィーとアミロース結合クロマトグラフィーを使用して精製され、タグ除去はタバコエッチングウイルスプロテアーゼを使用して除去しました。約4.5 mgの純粋なトレイルは、71.6％の精製収量で、125 mLのフラスコ培養から生成されました。最終産物のエンドトキシンレベルは、Limulus Amebocyte lysate Endotoxinアッセイで測定されたように、0.4 Eu/μgでした。精製されたトレイルは検証され、それぞれ0.6±0.03 nmおよび2.41±0.15のeC₅₀および丘係数を持つHeLa細胞のアポトーシスを引き起こすことが示されました。精製されたトレイルの投与後のHeLa細胞の高レベルのアポトーシスは、高品質で高収量のトレイルを生成するためのこの方法の重要性と斬新さを示しています。

Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) is considered as an antitumor agent owing to its ability to induce apoptosis of cancer cells without imparting toxicity toward most normal cells. TRAIL is produced in poor yield because of its insoluble expression in the cytoplasm of E. coli. In this study, we achieved soluble expression of TRAIL by fusing maltose-binding protein (MBP), b'a' domain of protein disulfide isomerase (PDIb'a'), or protein disulfide isomerase at the N-terminus of TRAIL. The TRAIL was purified using subsequent immobilized metal affinity chromatography and amylose-binding chromatography, with the tag removal using tobacco etch virus protease. Approximately 4.5 mg of pure TRAIL was produced from 125 ml flask culture with a purification yield of 71.6%. The endotoxin level of the final product was 0.4 EU/μg, as measured by the Limulus amebocyte lysate endotoxin assay. The purified TRAIL was validated and shown to cause apoptosis of HeLa cells with an EC₅₀ and Hill coefficient of 0.6 ± 0.03 nM and 2.41 ± 0.15, respectively. The high level of apoptosis in HeLa cells following administration of purified TRAIL indicates the significance and novelty of this method for producing high-grade and high-yield TRAIL.