VSV-GのQPCRアッセイを使用した複製有能なレンチウイルスの検出

レンチウイルスベクターは、ヒト疾患の治療のために細胞療法産物に新しい修正遺伝子を導入するために使用される一般的なツールです。レンチウイルスベクターは、宿主細胞ゲノムへの関心のある遺伝子の送達と安定した統合に理想的ですが、非標的に感染する可能性のある複製媒介性レンチウイルス（RCL）の生成など、人間の健康にリスクをもたらす可能性があります。セル。後者のリスクを考慮して、レンチウイルスベクターによって修正され、患者の使用を目的としたすべての細胞ベースの製品は、患者の治療前にRCLをテストする必要があります。現在の食品医薬品局（FDA）のガイドラインは、この目的に細胞ベースのアッセイを使用することを推奨しています。ただし、QPCRベースのアッセイは、新鮮な注入を目的とした製品におけるRCLの迅速な評価のための迅速な代替品です。ここでは、定量的リアルタイムPCR実験（MIQE）ガイドラインの最小情報に従って、RCLのエンベロープ遺伝子配列（小胞口内炎ウイルスG糖タンパク質[VSV-G]）の検出に基づくQPCRアッセイの開発と資格について説明します。。我々の結果は、VSV-Gシーケンスの検出の感度、直線性、特異性、および再現性を示し、偽陽性率が低いことを示しています。これらの手順は現在、フェーズ1の臨床調査で使用されています。

Lentiviral vectors are a common tool used to introduce new and corrected genes into cell therapy products for treatment of human diseases. Although lentiviral vectors are ideal for delivery and stable integration of genes of interest into the host cell genome, they potentially pose risks to human health, such as integration-mediated transformation and generation of a replication competent lentivirus (RCL) capable of infecting non-target cells. In consideration of the latter risk, all cell-based products modified by lentiviral vectors and intended for patient use must be tested for RCL prior to treatment of the patient. Current Food and Drug Administration (FDA) guidelines recommend use of cell-based assays to this end, which can take up to 6 weeks for results. However, qPCR-based assays are a quick alternative for rapid assessment of RCL in products intended for fresh infusion. We describe here the development and qualification of a qPCR assay based on detection of envelope gene sequences (vesicular stomatitis virus G glycoprotein [VSV-G]) for RCL in accordance with Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments (MIQE) guidelines. Our results demonstrate the sensitivity, linearity, specificity, and reproducibility of detection of VSV-G sequences, with a low false-positive rate. These procedures are currently being used in our phase 1 clinical investigations.