NF-κBレポーターを使用したマクロファージにおける長い非コーディングRNA（LNCRNA）のCRISPR/CASベースのスクリーニング

自然免疫系は、誘導性炎症反応を開始することにより、感染から保護します。NF-κBは、この複雑な応答を制御する重要な転写因子の1つですが、その調節のいくつかの側面は不明のままです。たとえば、長い非コーディングRNA（lncrNA）は遺伝子発現を批判的に調節することが示されていますが、これらのほんの一部のみが機能的に特徴付けられており、lncRNAS制御NF-κB発現が不明です。ここでは、不死化マウス骨髄由来マクロファージ（IBMDM）におけるGFPベースのNF-κBレポーターシステムの生成について説明します。Toll様受容体リガンドを使用したこのレポーターの活性化は、GFP発現をもたらし、フローサイトメトリーによって監視できます。また、このNF-κBレポーターラインにCRISPR/Cas9遺伝子欠失システムを確立し、NF-κBシグナル伝達を調節する遺伝子をスクリーニングできるようにしました。削除ベースのアプローチでは、NF-κBシグナル伝達を制御する2つの長い遺伝子間非コード（LINC）RNA、LinCRNA-Cox2およびLincrNA-AK170409を特定しました。細胞質のIκBα分解を促進する際に、LincrNA-Cox2の潜在的な新規役割を示しています。lincrna-ak170409については、この核局在したlincrnaが多くの炎症関連遺伝子を調節するという証拠を提供します。結論として、NF-κB-GFP IBMDMレポーター細胞株とCas9を安定して表現する株を確立しました。私たちのアプローチにより、lincrna-cox2およびlincrna-ak170409のNF-κB調節因子としての識別が可能になり、このツールは免疫機能に重要なこの転写因子の調節に関与する追加の遺伝子を特定するのに役立ちます。

The innate immune system protects against infections by initiating an inducible inflammatory response. NF-κB is one of the critical transcription factors controlling this complex response, but some aspects of its regulation remain unclear. For example, although long non-coding RNAs (lncRNAs) have been shown to critically regulate gene expression, only a fraction of these have been functionally characterized, and the extent to which lncRNAs control NF-κB expression is unknown. Here, we describe the generation of a GFP-based NF-κB reporter system in immortalized murine bone marrow-derived macrophages (iBMDM). Activation of this reporter, using Toll-like receptor ligands, resulted in GFP expression, which could be monitored by flow cytometry. We also established a CRISPR/Cas9 gene deletion system in this NF-κB reporter line, enabling us to screen for genes that regulate NF-κB signaling. Our deletion-based approach identified two long intergenic non-coding(linc)RNAs, lincRNA-Cox2 and lincRNA-AK170409, that control NF-κB signaling. We demonstrate a potential novel role for lincRNA-Cox2 in promoting IκBα degradation in the cytoplasm. For lincRNA-AK170409, we provide evidence that this nuclearly-localized lincRNA regulates a number of inflammation-related genes. In conclusion, we have established an NF-κB-GFP iBMDM reporter cell line and a line that stably expresses Cas9. Our approach enabled the identification of lincRNA-Cox2 and lincRNA-AK170409 as NF-κB regulators, and this tool will be useful for identifying additional genes involved in regulating this transcription factor critical for immune function.