[Embelinは、P-gpとMDR1 mRNAとは無関係にK562/dのダウノルビシンへのマルチラグ耐性を逆転させます]

目的：エンベリンによるドウノルビシンへのK562/d細胞の薬剤耐性を逆転させるメカニズムと、P-GPおよびMDR1 mRNAとの関係を調査する。 方法：MTTアッセイを使用して、DNR単独およびDNRとの治療の細胞増殖速度を検出および比較し、エンベリンと組み合わせました。アネキシンV-FITC/PI二重染色を使用したフローサイトメトリーを使用して細胞アポトーシス速度を検出し、ウエスタンブロットを使用して、DNRを単独で使用し、エンベリンと組み合わせた後、XIAP、カスパーゼ3、Bcl-2、BAX、およびP-gpの発現を検出しました。定量的リアルタイムPCRを使用して、XIAP、BCL-2、BAX、MDR1 mRNAを検出しました。 結果：DNRで24時間処理したK562およびK562/D細胞のIC50は、それぞれ2.177 µg/mLおよび69.43 µg/mLでした。薬物耐性指数は31.89でした​​。3、10、30、100、300 µg/mlのエンベリンで処理したK562/d細胞の増殖阻害速度は24時間2.70％±1.08％、10.92％±4.89％、28.13％±2.09％、36.56％±3.24％および43.59％±1.16％でした。0.1、1、10および100 µg/mlのDNRで処理したK562/D細胞の増殖阻害率は、10 µg/mLエンベリンと24時間組み合わせて31.92％±3.29％、49.57％±6.87％、55.16％±0.78％および71.94％±3.89％でした。IC50はそれぞれ2.11 µg/mlでした。逆インデックスは32.91でした。0.1 µg/mL DNR単独または10 µg/mLおよび30 µg/mLのエンボリンと24時間組み合わせたK562/D細胞のアポトーシス率は、それぞれ12.06％±0.95％、27.54％±0.59％および39.59％±1.57％でした。ウエスタンブロットの結果は、DNRとエンベリンの組み合わせの後、カスパーゼ-3の発現が有意にダウンレギュレートされたことを示しました（p <0.05）、さらに、細胞に対する薬物の組み合わせの増殖阻害効果は、Z-Vad-FMKによってcounteructedがx-vad-fmkによって積み起こされる可能性があることを示しました。上方制御（p <0.05）が、後のp-gp発現の変化はありませんでした（p <0.05）。RT-PCRの結果は、DNRとエンベリンの組み合わせでXIAPおよびBcl-2 mRNAの発現が有意にダウンレギュレートされた後（P <0.05）、BAX mRNAの発現が有意に上方制御されたことを示したが（P <0.05）、MDR1 mRNA発現の明らかな変化はなかった（p> 0.05）。 結論：XIAPのダウンレギュレーションは、K562/D細胞に対するDNRの効果を高めるために寄与します。K562/D細胞のDNRへの薬物耐性をエンベリン逆転させるメカニズムは、P-GPおよびMDR1 mRNAとは関係ありません。

OBJECTIVE: To investigate the mechanism of reversing drug resistance of K562/D cells to daunorubicin by Embelin and its relationship with P-gp and MDR1 mRNA. METHODS: MTT assay was used to detect and compare the cell proliferation rate of treating with DNR alone and DNR combined with Embelin. Flow cytometry with Annexin V-FITC/PI double staining was used to detect cell apoptosis rate, Western blot was used to detect the expression of XIAP,Caspase-3,BCL-2,BAX and P-gp of K562/D cells after using DNR alone and combining with Embelin. Quantitative real-time PCR was used to detect XIAP,BCL-2,BAX and MDR1 mRNA. RESULTS: The IC50 of K562 and K562/D cells treated with DNR for 24 h were 2.177 µg/ml and 69.43 µg/ml, respectively. The drug-resistance index was 31.89; The proliferation inhibition rates of K562/D cells treated with Embelin of 3, 10, 30, 100 and 300 µg/ml for 24 h were 2.70%±1.08%, 10.92%±4.89%, 28.13%±2.09%, 36.56%±3.24% and 43.59%±1.16%; The proliferation inhibition rates of K562/D cells treated with DNR of 0.1, 1, 10 and 100 µg/ml combined with 10 µg/ml Embelin for 24 h were 31.92%±3.29%, 49.57%±6.87%, 55.16%±0.78% and 71.94%±3.89%. The IC50 was 2.11 µg/ml respectively. The reverse index was 32.91. The apoptosis rates of K562/D cells treated with 0.1 µg/ml DNR alone or combined with Embelin of 10 µg/ml and 30 µg/ml for 24 h were 12.06%±0.95%, 27.54%±0.59% and 39.59%±1.57%, respectively. The results of Western blot showed that after combination of DNR with Embelin, the expression of Caspase-3 was significantly down-regulated (P<0.05), moreover, the prolifiration inhibition effect of drug combination on cells could be countreacted by Z-VAD-FMK, at the same time the expression of XIAP and BCL-2 protein was significantly down-regulated(P<0.05), the expression of BAX protein was significantly up-regulated(P<0.05), while there was no change of P-gp expression later (P<0.05). The results of RT-PCR showed that after combination of DNR with Embelin, expression of XIAP and BCL-2 mRNA was significantly down-regulated(P<0.05), expression of BAX mRNA was significantly up-regulated(P<0.05), while there was no obvious change of MDR1 mRNA expression(P>0.05). CONCLUSION: The down-regulation of XIAP contributes to enhance the effect of DNR on K562/D cells, the mechanism of Embelin-reversing the drug-resistence of K562/D cells to DNR does not relate with P-gp and MDR1 mRNA.