電気泳動サンプルバッファーへの尿素とチオウレアの添加により、PHOS-TAG SDS-PAGEのTCA/アセトン処理された平滑筋組織からのタンパク質抽出の効率が向上します

PHOS-TAG技術を使用したリン酸化分析は、平滑筋ミオシン調節光鎖（LC20）のリン酸化の非常に感度の高い定量化に適していることが報告されています。ただし、リン酸化分析の感度、つまりタンパク質抽出に影響を与える別の要因があります。ここでは、トリクロロ酢酸（TCA）固定組織から総タンパク質抽出の条件を最適化しました。標準的なSDSサンプルバッファーは、TCA/アセトン処理繊毛筋筋からサブユニット1（MYPT1）を標的とするLC20、アクチンおよびミオシンホスファターゼを抽出しました。一方、リチウムドデシル硫酸（LDS）またはSDSに加えて、尿素とチオウレアを含むサンプルバッファーは、これらのタンパク質をより効率的に抽出し、したがって、検出感度を4〜5倍まで増加させました。PHOS-TAG SDS-PAGEは、LDS/uREA/ThiouReaサンプルバッファーで抽出された脱リン酸化およびリン酸化LC20を分離し、標準のSDSバッファーのものと同じ程度まで抽出しました。LDS（またはSDS）/尿素/チオレアサンプルバッファーは、特にTCA/アセトンで処理される場合、平滑筋における高感度のリン酸化分析に適していると結論付けました。

Phosphorylation analysis by using phos-tag technique has been reported to be suitable for highly sensitive quantification of smooth muscle myosin regulatory light chain (LC20 ) phosphorylation. However, there is another factor that will affect the sensitivity of phosphorylation analysis, that is, protein extraction. Here, we optimized the conditions for total protein extraction out of trichloroacetic acid (TCA)-fixed tissues. Standard SDS sample buffer extracted less LC20 , actin and myosin phosphatase targeting subunit 1 (MYPT1) from TCA/acetone treated ciliary muscle strips. On the other hand, sample buffer containing urea and thiourea in addition to lithium dodecyl sulfate (LDS) or SDS extracted those proteins more efficiently, and thus increased the detection sensitivity up to 4-5 fold. Phos-tag SDS-PAGE separated dephosphorylated and phosphorylated LC20 s extracted in LDS/urea/thiourea sample buffer to the same extent as those in standard SDS buffer. We have concluded that LDS (or SDS) /urea/thiourea sample buffer is suitable for highly sensitive phosphorylation analysis in smooth muscle, especially when it is treated with TCA/acetone.